Περίληψη:
Οι τετρακυκλίνες (TCAs) είναι ευρέως φάσματος αντιβιοτικά που ενεργούν έναντι
ενός μεγάλου αριθμού gram + και gram – βακτηρίων. Έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς
σε παγκόσμια κλίμακα τόσο στην κτηνιατρική όσο και στην ιατρική. Αυτά τα
αντιβιοτικά χρησιμοποιούνται ευρύτατα ως κτηνιατρικά φάρμακα σε ζώα που
πρόκειται να καταναλωθούν λόγω της μεγάλης αντιμικροβιακής τους δράσης και του
χαμηλού κόστους. Οι συνηθέστερα χρησιμοποιούμενες τετρακυκλίνες στην
κτηνιατρική είναι η τετρακυκλίνη (TC), η οξυτετρακυκλίνη (OTC), η
χλωροτετρακυκλίνη (CTC) και η δoξυκυκλίνη (DC). Οι τετρακυκλίνες έχουν την τάση
να μετατρέπονται στα αντίστοιχα επιμερή τους. Αυτή η μετατροπή συνήθως λαμβάνει
χώρα σε υδατικά διαλύματα καθώς και σε βιολογικές μήτρες κατά τη διάρκεια
προκατεργασίας των δειγμάτων. Η Ευρωπαϊκή Ένωση έχει θέσει ανώτατο επιτρεπόμενο
όριο (MRL) , με σκοπό να εξασφαλίσει τους καταναλωτές από την έκθεσή τους σε
τρόφιμα ζωικής προέλευσης που περιέχουν κατάλοιπα τετρακυκλινών. Συγκεκριμένα
το ανώτατο επιτρεπόμενο όριο για τις TC, OTC, CTC,DC και των αντίστοιχων
επιμερών τους σε ιστό ψαριών είναι 0,1 μg/g (100 ng/g).
Στην παρούσα εργασία αναπτύχθηκε μια μέθοδος προσδιορισμού των τεσσάρων
τετρακυκλινών και τριών επιμερών σε ιστό ψαριού με υγροχρωματογραφία υψηλής
απόδοσης και ανιχνευτές UV – MS/MS. Αρχικά δοκιμάστηκαν τρεις διαφορετικές
αναλυτικές στήλες και βελτιστοποιήθηκαν διάφορες παράμετροι του χρωματογραφικού
συστήματος HPLC - UV, όπως η σύσταση, η ταχύτητα ροής και το pH της κινητής
φάσης καθώς και επιλέχθηκε το κατάλληλο πρόγραμμα βαθμιδωτής έκλουσης έτσι ώστε
να επιτευχθεί ικανοποιητικός διαχωρισμός των τετρακυκλινών και των αντίστοιχων
επιμερών τους. Στη συνέχεια έγινε μελέτη για την εκχύλιση των τετρακυκλινών και
των επιμερών τους, χρησιμοποιώντας δυο διαφορετικά εκχυλιστικά μέσα, το διάλυμα
Mcllvaine/EDTA (pH 4) και το ρυθμιστικό διάλυμα CH3COONH4-CH3COOH/EDTA (pH 4).
Επίσης για τον καθαρισμό του εκχυλίσματος δοκιμάστηκαν η εκχύλιση στερεάς φάσης
(SPE: C18, 101, HLB) και η εκχύλιση διασποράς στερεάς φάσης (dSPE με C18 και
PSA) επιλέγοντας τη δεύτερη ως καταλληλότερη διότι αποδείχτηκε ταχύτερη και
σταθερότερη και η μέθοδος μεταφέρθηκε στο σύστημα HPLC – MS/MS.
Τελικά, η μέθοδος επικυρώθηκε και οι παράμετροι που εκτιμήθηκαν ήταν η
γραμμικότητα, η πιστότητα (ανακτήσεις > 66,9%), η ακρίβεια (RSDR < 15%) και τα
όρια ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης τόσο του οργάνου όσο και της μεθόδου (LOD:
0,03 – 1,24 ng/g και LOQ: 0,09 – 3,72 ng/g). Η ποσοτικοποίηση γίνεται με την
χρήση καμπυλών εμβολιασμένων δειγμάτων και στην περίπτωση της DC, λόγω της
χαμηλής ανάκτησης (45,0%), η ποσοτικοποίηση γίνεται με την χρήση καμπυλών
εμβολιασμένων δειγμάτων και χρήση εσωτερικού προτύπου.
Λέξεις-κλειδιά:
Τετρακυκλίνες, Επιμερή, Spe, Dspe, lc ms ms
