Μονάδα:
Διατμηματικό / Διϊδρυτικό ΠΜΣ Μοριακή ΙατρικήΒιβλιοθήκη Επιστημών Υγείας
Ημερομηνία κατάθεσης:
2016-12-20
Συγγραφέας:
Μπουντούνη Πολυτίμη
Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Νικόλαος Ανάγνου, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Μαρία Ρουμπελάκη, Επίκουρη Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Ελένη Παπανικολάου, Λέκτορας, Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Πρωτότυπος Τίτλος:
Η γονιδιωματική εκδοτική επεξεργασία (genome editing) ως θεραπευτική προσέγγιση για τη μοριακή θεραπεία της β-θαλασσαιμίας
Γλώσσες εργασίας:
Ελληνικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
Η γονιδιωματική εκδοτική επεξεργασία (genome editing) ως θεραπευτική προσέγγιση για τη μοριακή θεραπεία της β-θαλασσαιμίας
Περίληψη:
Η β-θαλασσαιμία προκύπτει από διαταραχές στην παραγωγή της β-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης λόγω μεταλλάξεων στο β-γονίδιο. Ωστόσο, επειδή είναι γνωστό ότι η έκφραση της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF, α2γ2) στους θαλασσαιμικούς ασθενείς βελτιώνει σημαντικά την κλινική τους εικόνα, η επανενεργοποίηση της έκφρασης των ενδογενών γ-γονιδίων με στοχευμένη και ελεγχόμενη γενετική απαλοιφή γνωστών και καλά χαρακτηρισμένων καταστολέων της έκφρασής τους θα αποτελούσε μια δυνητική θεραπευτική προσέγγιση. Προς τον σκοπό αυτό, ο στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας υπήρξε η επιλεκτική αφαίρεση από το γονιδίωμα συγκεκριμένων καταστολέων της γ-σφαιρίνης, όπως το πρωτο-ογκογονίδιο c-myb και το ERV-9 LTR ρετροϊικό στοιχείο που βρίσκεται στο 5’ άκρο του γενετικού τόπου της β-σφαιρίνης, καθώς και η δημιουργία ελλειμμάτων τύπου HPFH (γειτνίαση των HPFH-1 και HPFH-2 ενισχυτών στο γονίδιο της γ-σφαιρίνης), μέσω της τεχνολογίας CRISPR/Cas9.
Σχεδιάστηκαν ειδικά RNAs-οδηγοί (guide RNAs), με το εργαλείο βιοπληροφορικής CRISPR Design, Feng Zhang lab, Massachusetts Institute of Technology (http://crispr.mit.edu/) και κλωνοποιήθηκαν σε πλασμιδιακό φορέα ως συνέχεια του γονιδίου που κωδικοποιεί την νουκλεάση Cas9 του Streptococcus pyogenes. Η ορθότητα της κλωνοποίησης των guide RNAs στα πλασμίδια ελέγχθηκε με αλληλούχιση κατά Sanger. Τα πλασμίδια εισήχθησαν με την τεχνική της πυρηνοδιάτρησης (nucleofection) στα αιμοποιητικά κύτταρα Κ562 και σε ανθρώπινα αρχέγονα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα CD34+ φυσιολογικών ατόμων και θαλασσαιμικών ασθενών. Τα κύτταρα, στη συνέχεια, διαφοροποιήθηκαν προς ερυθροειδικό φαινότυπο, προκειμένου να εκτιμηθεί το ποσοστό των κυττάρων που εξέφραζαν γ-σφαιρίνη με κυτταρομετρία ροής (FACS). Η απόδοση της πυρηνοδιάτρησης εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής και η αποτελεσματικότητα εισόδου της Cas9 νουκλεάσης στον πυρήνα για την πρόκληση των στοχευμένων δίκλωνων ρηγμάτων εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής και ανοσοφθορισμό.
Η αποτελεσματικότητα διαμόλυνσης των κυττάρων με τη μέθοδο του nucleofection ήταν 13.99% (n=3) και η απόδοση της εκδοτικής επεξεργασίας στους ανωτέρω γενετικούς τόπους υπολογίστηκε πως αφορούσε το 10.9% (n=3) του ολικού κυτταρικού πληθυσμού. Η πυρηνοδιάτρηση με τα 5μg των CRISPR/Cas9 πλασμιδίων για την απαλοιφή του γονιδίου c-myb οδήγησε σε 63.6% αύξηση του ποσοστού των Κ562 κυττάρων που εξέφραζαν γ-σφαιρίνη, σε 65.4% (n=2) αύξηση στα φυσιολογικά CD34+ κύτταρα και σε 50.4% αύξηση στα θαλασσαιμικά CD34+ κύτταρα. Στην περίπτωση της δημιουργίας του ελλείμματος HPFH-2, τα αιμοποιητικά βλαστικά CD34+ κύτταρα από φυσιολογικά άτομα εμφάνισαν αύξηση του ποσοστού των F κυττάρων κατά 20.9% (n=4). Κατά τη δημιουργία του ελλείμματος HPFH-1 σε CD34+ κύτταρα φυσιολογικών ατόμων, σημειώθηκε αύξηση κατά 19% (n=2) στο ποσοστό των F κυττάρων, ενώ κατά την πυρηνοδιάτρηση CD34+ κυττάρων φυσιολογικών ατόμων για την απαλοιφή του ERV-9 LTR στοιχείου παρατηρήθηκε 92% (n=2) αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που εξέφραζαν γ-σφαιρίνη.
Τα αποτελέσματα της παρούσας διπλωματικής εργασίας τεκμηριώνουν μία σημαντική αύξηση στα επίπεδα έκφρασης της γ-σφαιρίνης, παρά τη σχετικά χαμηλή απόδοση της τεχνικής. Τα δεδομένα αυτά αποδεικνύουν αφ’ ενός τη δυναμική της νέας τεχνολογίας της γονιδιωματικής εκδοτικής επεξεργασίας και αφ’ ετέρου υποδηλώνουν ότι ενδεχόμενη περαιτέρω βελτίωση της αποτελεσματικότητάς της έχει τη δυνατότητα να οδηγήσει σε θεραπευτικά επίπεδα έκφρασης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης HbF στα θαλασσαιμικά αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα.
Κύρια θεματική κατηγορία:
Επιστήμες Υγείας
Λέξεις-κλειδιά:
Μοριακή θεραπεία, Γονιδιακή θεραπεία, β-θαλασσαιμία, Γονιδιωματική εκδοτική επεξεργασία, CRISPR/Cas9 σύστημα, Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
0
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
176
Αρχείο:
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο. H πρόσβαση επιτρέπεται μόνο εντός του δικτύου του ΕΚΠΑ.
Διπλωματική εργασία - Πολυτίμη Μπουντούνη .pdf
3 MB
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο. H πρόσβαση επιτρέπεται μόνο εντός του δικτύου του ΕΚΠΑ.
