Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Σπύρος Ευθυμιόπουλος, Καθηγήτης, Βιολογικό, ΕΚΠΑ
Κώστας Βεκρέλλης, Β' Ερευνητής, ΙΙΒΕΑΑ, Αθήνα
George Tofaris, Associate Prof., NDCN, Oxford University
Περίληψη:
H νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ), είναι η δεύτερη πιο κοινή νευροεκφυλιστική διαταραχή μετά τη νόσο του Αλτσχάιμερ (ΝΑ) και χαρακτηρίζεται από την προοδευτική απώλεια των ντοπαμινεργικών νευρώνων στην μέλαινα ουσία pars compacta. Χαρακτηριστικό γνώρισμα της νόσου είναι η παρουσία ενδονευρωνικών πρωτεϊνικών εγκλεισμάτων, τα οποία αναφέρονται ως σωμάτια Lewy με κύριο συστατικό την πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη. Ασθενείς με τριπλασιασμούς στο γονίδιο που κωδικοποιεί για την α-συνουκλεΐνη εμφανίζουν άνοια σε μικρότερη ηλικία από εκείνους με διπλασιασμούς, το οποίο υποδεικνύει μία συσχέτιση με τα επίπεδα της α-συνουκλεΐνης και την κλινική σοβαρότητα της ασθένειας. Έτσι η ρύθμιση της αποικοδόμησης της θα μπορούσε να αποτελέσει μια θεραπευτική στρατηγική στην ΝΠ. Η α-συνουκλεΐνη αποικοδομείται από το πρωτεάσωμα και το λυσόσωμα, με το τελευταίο να έχει εμφανιστεί ως την πιο σχετική οδό αποικοδόμησης στην ΝΠ. Τόσο η μακροαυτοφαγία οσο και η αυτοφαγία μεσολαβούμενη από σαπερονες (ΑΜΣ), έχουν εμπλακεί στην αποικοδόμηση της α-συνουκλεΐνης, καθώς και στην έκκριση της. Σε έρευνες που ενίσχυαν την αυτοφαγία μεσολαβούμενη από σαπερονες, με υπερέκφραση του λυσοσωμικού υποδοχέα Lamp2a, είχε ως αποτέλεσμα την μείωση της α-συνουκλεΐνης και της νευροτοξικότητα της.
Στη μελέτη μας αποδυναμώσαμε το μονοπάτι της ΑΜΣ με χρήση λεντοϊών που εκφραζουν αλληλουχιες shRNA που προκαλουν σιγαση στο Lamp2a σε νευρώνες ποντικιου με ταυτόχρονη αδενοϊική υπερεκφράση της αγρίου τύπου α-συνουκλεΐνης. Τα ενδοκυτταρικά επίπεδα της α-συνουκλεΐνης ήταν ιδιαίτερα αυξημένα, καθώς και οι ολιγομερείς μορφές της, που πιστεύεται ότι είναι συμβάλουν στην τοξικότητάς της. Είναι σημαντικό ότι, η έκκριση της α-συνουκλεΐνης ήταν αξιοσημείωτα αυξημένη, γεγονός που υποδηλώνει ότι δυσλειτουργία του μονοπατιού επηρεάζει την απελευθέρωση της από το κύτταρο και ενδεχομένως την επακόλουθη διάδοση της πρωτεΐνης. Σε συμφωνία με τις προηγούμενες μελέτες η υπερέκφραση του Lamp2a έδειξε μειωμένα επίπεδα της α-συνουκλεΐνης, αλλά επίσης και τα ολιγομερή της πρωτείνης. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτή η προσέγγιση διασώσει τα αυξημένα επίπεδα της α-συνουκλεΐνης απελευθερώνονται από το κύτταρο τα οποία σημειώθηκαν στην Lamp2a σίγαση. Έτσι, φαίνεται ότι μονοπάτι αυτό ρυθμίζει την απελευθέρωση της α-συνουκλεΐνης και στοχεύοντας αυτό το μονοπάτι θα μπορούσε να επιφέρει ανακούφιση από τα αποτελέσματά της.
Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι ένα μέρος της α-συνουκλεΐνης είναι ουμπικουιτινημένο στα σωμάτια Lewy. Έτσι, τα ένζυμα που ρυθμίζουν ουμπικουιτίνωση θα μπορούσαν να συμβάλουν στην μείωσή της. Το ένζυμο αποουμπικουιτινάση, USP8, βρέθηκε να εμπλέκεται στην μέσω ενδοσωμάτων και την αποικοδόμηση διάφορων πρωτεϊνών με την ικανότητά του να αφαιρέσει τις αλυσίδες ουμπικουιτίνης. Πρόσφατα έχει βρεθεί ότι εγκλείσματα της α-συνουκλεΐνης περιέχουν Κ63-συνδεδεμένες αλυσίδες ουμπικουιτίνης και το Usp8 λειτουργούσε ως ρυθμιστής της διαδικασίας αυτής καθώς επάγεται σε σωμάτια Lewy και σχετίζεται αντιστρόφως με τα επίπεδα των Κ63 αλυσίδων ουμπικουιτίνης. Μελέτες σε μύγες δείχνουν ότι το Usp8 αλληλοεπιδρά με την α-συνουκλεΐνη και αυξάνει τα επίπεδα της. Επιπλέον μείωση του ενζύμου αυτού μειώνει την τοξικότητα που επάγεται από την α-συνουκλεΐνη στο σύστημα αυτό.
Ως εκ τούτου, πραγματοποιήσαμε μεταγωγή με λέντοϊο ο οποίος εκφράζει shRNA έναντι του USP8 ή SCR στην κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος SH-SY5Y και ελέγξαμε τα επίπεδα της α-συνουκλεΐνης. Τα προϊόντα λύσης κλασματοποίηθηκαν ώστε να χωριστούν σε κυτοσολικό και μεμβρανικό κλάσμα με το τελευταίο να είναι εμπλουτισμένο σε ενδοσωμικά-λυσοσωμικά μέρη. Σίγαση του USP8 είχε ως αποτέλεσμα την μείωση των επιπέδων της α-συνουκλεΐνης στο μεμβρανικό κλάσμα. Επιπλέον, κατά την αναστολή του λυσοσώματος αλλά όχι του πρωτεασώματος, η α-συνουκλεΐνη συσσωρευόταν, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αποικοδόμησης της πραγματοποιήθηκε μέσω του λυσοσώματος. Ωστόσο η έκκριση της πρωτεΐνης δεν επηρεάστηκε. Διερευνώντας τον μηχανισμό μέσω του οποίου τι USP8 ρυθμίζει τα επίπεδα της α-συνουκλεΐνης βρέθηκε ότι το USP8 μπορεί να ενεργοποιήσει την αυτοφαγία στα πρώτα της στάδια, αφού ελεγχθήκαν οι αυτοφαγικοί δείκτες καθώς και τα επίπεδα των αυτοφαγοσωμάτων. Το USP8 αλληλοεπιδρά και σταθεροποιεί το σύμπλεγμα ESCORT-0, το οποίο εμπλέκεται στη ρύθμιση της ενδοσωματικής μετακίνησης των πρωτεϊνών την λυσοσωμική αποικοδόμησή τους. Ωστόσο, βρήκαμε ότι η αποικοδόμησή της α-συνουκλεΐνης δεν συνέβη μέσω αυτού του συμπλόκου καθώς η σίγαση του δεν επηρέαζε τα επίπεδα της. Επίσης σημαντικό είναι ότι μετά τη σίγαση του USP8 βρέθηκε ότι η κυτταρική σειρά αυτή έχει καλύτερη βιωσιμότητα και επίσης θα μπορούσε να διασώσει τα κύτταρα από το στρες μετά από θερμικό σοκ.
Στη συνέχεια για να επικυρώσουμε αυτά τα αποτελέσματα χρησιμοποιήσαμε αναστολείς του USP8 και βρήκαμε ότι ένας εκ αυτών μείωνε σημαντικά τα επίπεδα της α-συνουκλεΐνης. Σε συμφωνία με την αποσιώπηση του USP8, η αναστολή του δεν φάνηκε να επηρεάζει την απελευθέρωση της α-συνουκλεΐνης. Αξίζει να σημειωθεί ότι η αναστολή του USP8, φαίνεται ότι δεν ενεργοποιεί το μονοπάτι της αυτοφαγία. Το USP8 φαίνεται να είναι ένας κρίσιμος παράγοντας που καθορίζει τα επίπεδα της α-συνουκλεΐνης και θα μπορούσε να είναι στόχος για θεραπείες.
Συμπερασματικά αυτή η μελέτη κατέδειξε τη σημασία των οδών αποικοδόμησης της α-συνουκλεΐνης, έναν κρίσιμο παράγοντα στη ΝΠ παθογένεια. Η ρύθμιση των οδών αυτών θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως θεραπευτική προσέγγιση στην ΝΜ ή άλλες συνουκλεϊνοπάθειες.
Λέξεις-κλειδιά:
Α-συνουκλείνη, Συστήματα αποικοδόμησης, Ασθένεια Πάρκινσον, Αυτοφαγία, Εγκέφαλος
