Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Τσοτίνης Ανδρέας, Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής ΕΚΠΑ
Μαράκος Παναγιώτης, Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής ΕΚΠΑ
Πουλή Νικολαΐς, Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής ΕΚΠΑ
Παπαδόπουλος Μηνάς, Ερευνητής Α', Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α. ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ
Πιρμεττής Ιωάννης, Ερευνητής Α', Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α. ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ
Πελεκάνου Μαρία, Ερευνήτρια Α', Ι.Β.Ε. ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ
Παραβατού Μαρία, Ερευνήτρια Β', Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α. ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ
Περίληψη:
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή σχεδιάστηκαν, συντέθηκαν και χαρακτηρίστηκαν πλήρως νέα σύμπλοκα του ρηνίου τόσο στην οξειδωτική βαθμίδα (V) όσο και στην οξειδωτική βαθμίδα (Ι) και μελετήθηκαν ως προς την αντικαρκινική τους δράση.
Στην πρώτη κατηγορία συμπλόκων του ρηνίου που μελετήθηκε, ανήκουν σύμπλοκα στην οξειδωτική βαθμίδα (V) του γενικού τύπου ReO(SNO)(NN) (κατηγορία 1), όπου SNO είναι ο τριδοτικός υποκαταστάτης Ν-(2-μερκαπτοπροπιονυλ)γλυκίνη (CH3-SNO) ή Ν-(2-μερκσπτοακετυλ)γλυκίνη (SNO) και ΝΝ o διδοτικός υποκαταστάτης 2,2’-διπυριδίνη (bpy), ή 7-φθοροδιπυριδο[3,2-a:2΄,3΄-c]φαιναζίνη (F-dppz), ή βενζο[i]διπυριδο[3,2-a:2',3'-c]φαιναζίνη (dppn), όπου το F-dppz και dppn είναι μόρια – παρεμβολείς. Τα οξορρηνικά σύμπλοκα με τη bpy, (ReO(CH3-SNO)(bpy) και ReO(SNO)(bpy)) χρησιμοποιήθηκαν ως ενώσεις αναφοράς.
Όλα τα οξορρηνικά σύμπλοκα (ReO(CH3-SNO)(bpy), ReO(SNO)(bpy), ReO(CH3-SNO)(F-dppz) ReO(SNO)(F-dppz), ReO(CH3-SNO)(dppn)) συντέθηκαν με αντίδραση του πρόδρομου συμπλόκου ReOCl3(PPh3)2 με τον τριδοτικό και τον διδοτικό υποκαταστάτη σε μεθανόλη με καλές αποδόσεις (70 – 80 %). Τα σύμπλοκα χαρακτηρίστηκαν με στοιχειακή ανάλυση, IR και NMR φασματοσκοπία. Από τις φασματοσκοπίες IR και NMR καθώς και από την κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ έγινε φανερή η ύπαρξη δύο διαστερεομερών syn και anti για τα σύμπλοκο που έχουν τον CH3-SNO ως τριδοτικό υποκαταστάτη. Η δομή των συμπλόκων syn-ReO(CH3-SNO)(bpy), anti-ReO(CH3-SNO)(bpy), ReO(SNO)(bpy) και ReO(SNO)(F-dppz) επιβεβαιώθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ.
Τα οξορρηνικά σύμπλοκα μελετήθηκαν ως προς την δράση τους έναντι της ανθρώπινης καρκινικής κυτταρικής σειράς HeLa (τραχήλου της μήτρας) μέσω της μεθόδου ΜΤΤ. Το σύμπλοκο ReO(CH3-SNO)(F-dppz) εμφάνισε τη μεγαλύτερη δραστικότητα με ΙC50 ~ 10 μΜ. Τα υπόλοιπα σύμπλοκα της σειράς εμφάνισαν τιμές ΙC50 στην ίδια τάξη μεγέθους (ΙC50 = 10.71 ‒ 16.77 μΜ).
Εν συνεχεία συντέθηκαν σύμπλοκα του ρηνίου στην οξειδωτική βαθμίδα (Ι) με γενικό τύπο fac-[Re(CO)3(NN)L]0/+ (κατηγορία 2) όπου οι διδοτικοί υποκαταστάτες είναι τα μόρια – παρεμβολείς της κατηγορίας 1 (F-dppz, dppn) και ως μονοδοτικοί υποκαταστάτες χρησιμοποιήθηκαν το βρώμιο (Br), το ακετονιτρίλιο (MeCN), το κυκλοεξυλισοκυανίδιο (cisc) και το 1,3,5-τριαζα-7-φωσφαδαμαντάνιο (ΡΤΑ) έτσι ώστε να συμπληρωθεί η σφαίρα συναρμογής του μετάλλου. Τα σύμπλοκα που προέκυψαν ήταν τα Re(CO)3(F-dppz)Br, [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6, [Re(CO)3(F-dppz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(F-dppz)(PTA)]PF6, Re(CO)3(dppn)Br, [Re(CO)3(dppn)(MeCN)]PF6, [Re(CO)3(dppn)(cisc)]PF6 και [Re(CO)3(dppn)(PTA)]PF6.
Τα κατιοντικά σύμπλοκα [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6 και [Re(CO)3(dppn)(MeCN)]PF6 προέκυψαν από αντίδραση των αντίστοιχων ουδέτερων συμπλόκων Re(CO)3(F-dppz)Br και Re(CO)3(dppn)Br με τον AgPF6 σε διαλύτη ακετονιτρίλιο. Τα σύμπλοκα [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6 και [Re(CO)3(dppn)(MeCN)]PF6 χρησιμοποιήθηκαν ως ενδιάμεσα σύμπλοκα και με αντίδρασή τους με τον μονοδοτικό υποκαταστάτη cisc ή PTA σε χλωροφόρμιο ή μεθανόλη προκύπτουν τα κατιοντικά σύμπλοκα [Re(CO)3(F-dppz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(F-dppz)(PTA)]PF6, [Re(CO)3(dppn)(cisc)]PF6 και [Re(CO)3(dppn)(PTA)]PF6. Οι αποδόσεις των συμπλόκων ήταν υψηλές (77 – 91%). Ο χαρακτηρισμός των συμπλόκων έγινε με στοιχειακή ανάλυση, IR και NMR φασματοσκοπία. Η δομή του [Re(CO)3(F-dppz)(MeCN)]PF6 επιβεβαιώθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ.
Τα σύμπλοκα της κατηγορίας 2 μελετήθηκαν ως προς την δράση τους έναντι των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών HeLa (τραχήλου της μήτρας) και MCF-7 (μαστού). Tα σύμπλοκα Re(CO)3(F-dppz)(cisc) και Re(CO)3(dppn)(cisc) είχαν τη μεγαλύτερη δραστικότητα (ΙC50 = 0.13 – 6.14 μΜ) έναντι και των δυο καρκινικών κυτταρικών σειρών.
Στην τρίτη και τελευταία κατηγορία, ο γενικός των τύπος των συμπλόκων είναι fac-[Re(CO)3(NNbz)L]0/+ (κατηγορία 3) όπου ως ΝΝ διδοτικός υποκαταστάτης χρησιμοποιείται το παράγωγο του βενζοθειαζολίου 4-(βενζο[d]θειαζολo-2-yl)-N-(πυριδινo-2-yl-μεθυλ)ανιλίνη) (NNbz) και ως μονοδοτικοί υποκαταστάτες το βρώμιο (Br), το ακετονιτρίλιο (MeCN), το κυκλοεξυλισοκυανίδιο (cisc), η τριφαινυλοφωσφίνη (PPh3), το 1,3,5-τριαζα-7-φωσφαδαμαντάνιο (PTA) και η πυριδίνη (py). Τα σύμπλοκα που προέκυψαν ήταν τα Re(CO)3(ΝΝbz)Br, [Re(CO)3(NNbz)(MeCN)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PPh3)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PTA)]PF6 και [Re(CO)3(ΝΝbz)(py)]PF6.
Το κατιοντικό σύμπλοκο [Re(CO)3(NNbz)(MeCN)]PF6 χρησιμοποιήθηκε ως ενδιάμεσο σύμπλοκο και προέκυψε από αντίδραση του ουδέτερου συμπλόκου Re(CO)3(ΝΝbz)Br με τον AgPF6 σε διαλύτη ακετονιτρίλιο. Το ενδιάμεσο σύμπλοκο [Re(CO)3(NNbz)(MeCN)]PF6 αντιδρά με τους μονοδοτικούς υποκαταστάτες cisc ή PPh3 ή PTA ή py σε διαλύτη χλωροφόρμιο ή μεθανόλη και προκύπτουν τα κατιοντικά σύμπλοκα [Re(CO)3(NNbz)(cisc)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PPh3)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PTA)]PF6 και [Re(CO)3(ΝΝbz)(py)]PF6. Οι αποδόσεις των συμπλόκων ήταν υψηλές 81 – 94%. Ο χαρακτηρισμός των συμπλόκων έγινε με φασματοσκοπία IR, NMR, και στοιχειακή ανάλυση. Η δομή των συμπλόκων Re(CO)3(NNbz)Βr, [Re(CO)3(NNbz)(ΟΗ2)]PF6, [Re(CO)3(NNbz)(PPh3)]PF6 και [Re(CO)3(NNbz)(PTA)]PF6 επιβεβαιώθηκε με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ.
Οι μελέτες κυτταρικής πρόσληψης που ακολούθησαν αποκάλυψαν ότι τα σύμπλοκα περνούν την κυτταρική μεμβράνη και υπάρχουν διάχυτα στο κυτταρόπλασμα.
Επίσης, τα σύμπλοκα της κατηγορίας 3 μελετήθηκαν ως προς την δράση τους έναντι των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, HeLa (τραχήλου της μήτρας), MCF-7 (μαστού) και Α431 (επιδερμοειδές), μέσω της μεθόδου ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα ήταν ιδιαιτέρως ενθαρρυντικά. Συγκεκριμένα, τα σύμπλοκα που εμφάνισαν τη μεγαλύτερη δραστικότητα είναι τα Re(CO)3(NNbz)(cisc) και Re(CO)3(NNbz)(PPh3) (IC50 = 0.19 - 0.61 μM).
Επίσης, μελετήθηκε η αλληλεπίδραση των συμπλόκων και των τριων κατηγοριών με DNA θύμου αδένα βοοειδούς μέσω κυκλικού διχρωϊσμού, ανταγωνιστικών μελετών φθορισμού και ιξωδομετρίας όπου φαίνεται ότι όλα τα σύμπλοκα αλληλεπιδρούν ισχυρά με το DNA μέσω ενδοπαρεμβολής.
Ακολούθως, πραγματοποιήθηκαν μελέτες κυτταρικού κύκλου για τα σύμπλοκα της κατηγορίας 3. Πολύ ενδιαφέροντα αποτελέσματα είχε το σύμπλοκο Re(CO)3(NNbz)(cisc) το οποίο βρέθηκε ότι προκαλεί αύξηση της κατανομής του κυτταρικού πληθυσμού τόσο στη G1 όσο και στη G2 φάση διαταράσσοντας πλήρως τον κυτταρικό κύκλο στις καρκινικές κυτταρικές σειρές ΗeLa και ΜCF-7. Τα υπόλοιπα σύμπλοκα προκαλούν αύξηση της κατανομής του κυτταρικού πληθυσμού στη φάση G2/M.
Τέλος, παρασκευάστηκε επιτυχώς το 99mTc(CO)3(NNbz)(cisc) σε υψηλή απόδοση (>95%) χρησιμοποιώντας ως πρόδρομο σύμπλοκο το [99mTc(CO)3(OH2)]+. Ακολούθησαν in vivo μελέτες βιοκατανομής του 99mTc(CO)3(NNbz)(cisc) σε υγιή ποντίκια και σε ποντίκια που φέρουν όγκο με τα αποτελέσματα να δείχνουν ικανοποιητική πρόσληψη ραδιενέργειας του συμπλόκου στον όγκο.
