Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Μενέλαος Ν. Μανουσάκης,Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Αθανάσιος Γ. Τζιούφας, Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Παναγιώτης Βλαχογιαννόπουλος, Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Μιχαήλ Κουτσιλιέρης, Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Κλειώ Μαυραγάνη, Αναπλ. Καθηγήτρια, Ιατρική ΕΚΠΑ
Ευσταθία Καψογεώργου, Επ. Καθηγήτρια, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Εύα Κασσή, Αναπλ. Καθηγήτρια, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Το σύνδρομο Sjogren (SS) ή η αυτοάνοση επιθηλίτιδα είναι μια μάλλον συχνή αυτοάνοση εξωκρινοπάθεια που χαρακτηρίζεται από χρόνια δυσλειτουργία και καταστροφή των εξωκρινών αδένων (κυρίως των σιελογόνων και δακρυϊκών αδένων). Το SS μπορεί να υπάρχει είτε μόνο του (πρωτοπαθές SS), είτε σε συνδυασμό με άλλες αυτοάνοσες παθήσεις (δευτεροπαθές ή συσχετιζόμενο SS). H εκδήλωση του SS μπορεί να κυμαίνεται από νόσο που περιορίζεται στους εξωκρινείς αδένες (οργανο-ειδική εξωκρινοπάθεια), σε νόσο με ποικίλες εξω-αδενικές εκδηλώσεις (συστημική νόσος), έως σε νόσο με ανάπτυξη λεμφώματος Β-λεμφοκυττάρων (μη-Hodgkin λέμφωμα, NHL). Περίπου το ένα τρίτο των ασθενών εμφανίζουν κλινικά και εργαστηριακά χαρακτηριστικά που αποτελούν προγνωστικούς παράγοντες υψηλού κινδύνου για την ανάπτυξη λεμφώματος NHL.
Στο παρελθόν, πολλαπλά πειραματικά δεδομένα από το εργαστήριό μας έχουν υποδείξει ότι τα πορικά επιθηλιακά κύτταρα κατέχουν κεντρικό παθογενετικό ρόλο στο SS. Επιπλέον, μια σειρά από δεδομένα υποδεικνύουν τη συμβολή τόσο της έμφυτης όσο και της επίκτητης ανοσίας στην ανάπτυξη των χρόνιων φλεγμονωδών αλλοιώσεων που χαρακτηρίζουν το σύνδρομο. Οι προχωρημένες λεμφο-επιθηλιακές βλάβες στους σιελογόνους αδένες των ασθενών με SS χαρακτηρίζονται κυρίως από έκφραση κυτταροκινών τύπου Th1, συμπεριλαμβανομένης της αυξημένης παραγωγής ιντερφερόνης-γ (ΙFΝγ), μιας κυτταροκίνης που πιθανότατα εμπλέκεται άμεσα στην καταστροφή του επιθηλίου.
Η ιντερλευκίνη-18 (IL-18) και η IL-12 είναι πλειότροπες φλεγμονώδεις κυτταροκίνες με εξαιρετικά σημαντικό συνεργιστικό ρόλο στην παραγωγή IFNγ, αποτελώντας κεντρικούς ρυθμιστές της χρόνιας φλεγμονής στα αυτοάνοσα νοσήματα. Παρόμοια με την IL-1β, η IL-18 συντίθεται ως βιολογικά αδρανής πρόδρομη μορφή (pro-IL18) η οποία εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα μυελοειδών και επιθηλιακών κυττάρων και χρειάζεται πρωτεολυτική διάσπαση για την έκκρισή της ως δραστική IL-18. Η διάσπαση της pro-IL18 σε ώριμη IL-18 εξαρτάται από τη δράση της κασπάσης-1, που ενεργοποιείται μετά την συγκρότηση των φλεγμονοσωμάτων (inflammasomes). Τα φλεγμονοσώματα είναι μια ομάδα πρωτεϊνικών συμπλόκων με πολλές υπομονάδες που αποτελούν μια εξαιρετικά σημαντική κυτταρική πλατφόρμα για την επαγωγή της έμφυτης ανοσολογικής απόκρισης. Η πλατφόρμα αυτή συγκροτείται από μόρια κυτταροπλασματικών “αισθητήρων” (όπως οι πρωτεΐνες NLRP3 και AIM2), το μόριο-προσαρμοστής ASC και η κασπάση-1. Η ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος οδηγεί στην παραγωγή των δραστικών μορφών των φλεγμονωδών κυτταροκινών IL-1β και IL-18, καθώς και στην ενεργοποίηση ενός ιδιαίτερα φλεγμονώδους τύπου κυτταρικού θανάτου που ονομάζεται πυρόπτωση.
Προηγούμενα, έχει διαπιστωθεί ότι οι φλεγμονώδεις διηθήσεις στους ελάσσονες σιελογόνους αδένες (ΕΣΑ) ασθενών με SS εμφανίζουν υψηλή έκφραση της IL-18 από τα μακροφάγα και τα επιθηλιακά κύτταρα, καθώς και της IL-12 από τα Β-λεμφοκύτταρα. Επιπλέον, έχει δειχθεί η θετική συσχέτιση των αυξημένων ορολογικών επιπέδων IL-18 με την παραγωγή αυτοαντισωμάτων anti-Ro(SSA) και αντι-La(SSB) στους ασθενείς με πρωτοπαθές SS. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, η κλινική σημασία της έκφρασης των πρωτεϊνών IL-18 και IL-12 στους σιελογόνους ιστούς των ασθενών με SS δεν είχε διερευνηθεί. Από την άλλη πλευρά, πρόσφατα πειραματικά στοιχεία έχουν υποδείξει την συμμετοχή της ενεργοποίησης του φλεγμονοσώματος στην παθογένεση του SS, συμπεριλαμβανομένης της υψηλής επιτόπιας (in-situ) έκφρασης της κυτταροκίνης IL-1β και της ενεργοποίησης του άξονα του φλεγμονοσώματος-P2X7R. Επιπλέον, προηγούμενες μελέτες σε ασθενείς και ζωϊκά μοντέλα με ξηροφθαλμία έχουν επίσης υποδηλώσει την εμπλοκή του φλεγμονοσώματος NLRP3 στην εξωκρινοπάθεια του SS. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, η κατάσταση ενεργοποίησης των φλεγμονοσωμάτων στα διάφορα βιολογικά διαμερίσματα των ασθενών με SS και η σχέση της με τις κλινικές και εργαστηριακές εκδηλώσεις της νόσου δεν είχαν διερευνηθεί.
Ο πρώτος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος της IL-18 στις φλεγμονώδεις λεμφοεπιθηλιακές αλλοιώσεις, καθώς και στις εκδηλώσεις της νόσου στους ασθενείς με SS. Δεδομένης της συνεργιστικής δράσης της IL-18 με την IL-12 στην παραγωγή της ΙFΝγ, η έκφραση των δύο αυτών κυτταροκινών αξιολογήθηκε παράλληλα. Ο δεύτερος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν ο προσδιορισμός της κατάστασης της ενεργοποίησης του φλεγμονοσώματος στο περιφερικό αίμα και στους ιστούς σιελογόνων αδένων ασθενών με SS, καθώς και της κλινικής σημασίας αυτής.
Για τον σκοπό αυτό, η πρωτεϊνική έκφραση των pro-IL-18, IL-18 και IL-12 στα κύτταρα που διηθούν τους σιελογόνους αδένες αξιολογήθηκε με ανοσοϊστοχημεία μονής και διπλής χρώσης σε δείγματα ΕΣΑ από ασθενείς με πρωτοπαθές και δευτεροπαθές SS. Επίσης αξιολογήθηκε η έκφραση mRNA και πρωτεΐνης για ποικίλα μόρια που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος, σε δείγματα ορού, μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) και ΕΣΑ με τεχνικές ELISA, RT-PCR και συνεστιακή μικροσκοπία, αντίστοιχα. Επιπλέον, επινοήθηκε ένας νέος σύνθετος δείκτης για την ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος NLRP3 (αθροιστικός βαθμός έκφρασης NLRP3, που περιλαμβάνει την έκφραση διαφόρων γονιδίων σχετιζόμενων με το φλεγμονόσωμα NLRP3). Τέλος, προκειμένου να εξετάσουμε την κλινική σημασία αυτών των παραγόντων του φλεγμονοσώματος στο SS, διερευνήσαμε τη συσχέτιση της έκφρασής τους με διάφορες παραμέτρους της νόσου, συμπεριλαμβανομένων των δεικτών βαρύτητας της νόσου και της παρουσίας δυσμενών προγνωστικών δεικτών για την ανάπτυξη NHL λεμφώματος.
Οι ΕΣΑ από ασθενείς με SS (αλλά όχι από μάρτυρες νόσου) παρουσίασαν αυξημένη διήθηση από μακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα, ισχυρή έκφραση της IL-18 από τα διηθούντα μακροφάγα (ειδικά στις περιοχές με σημαντική παρουσία Β-λεμφοκυττάρων και στις περιοχές που προσομοιάζουν με βλαστικά κέντρα), καθώς και σημαντική έκφραση της IL-12 στις διηθήσεις από μονοπύρηνα κύτταρα. Ο βαθμός διήθησης από τα κύτταρα που εκφράζουν IL-18 συσχετίστηκε σημαντικά και θετικά με ποικίλους δείκτες της in situ αδενικής φλεγμονής σε ασθενείς με πρωτοπαθές SS, συμπεριλαμβανομένης της βαρύτητας των συνολικών διηθήσεων από μονοπύρηνα κύτταρα, καθώς και ειδικά από μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, και Β-λεμφοκύτταρα. Από την άλλη πλευρά, ο βαθμός διήθησης από τα κύτταρα που εκφράζουν την IL-18 συσχετίστηκε αντίστροφα με τον βαθμό διήθησης από IL-12 θετικά κύτταρα. Επιπλέον, η έκφραση της IL-18 στους ΕΣΑ των ασθενών συσχετίστηκε θετικά με την παρουσία κλινικών και ορολογικών παραγόντων κινδύνου για την ανάπτυξη λεμφώματος Β-λεμφοκυττάρων (όπως η διόγκωση των σιελογόνων αδένων και η παρουσία χαμηλών ορολογικών επιπέδων κλάσματος C4 του συμπληρώματος).
Σε σύγκριση με τα υγιή άτομα, τα PBMC των ασθενών βρέθηκαν να παρουσιάζουν σημαντικά αυξημένα επίπεδα ποικίλων μεταγράφων mRNA των γονιδίων που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος NLRP3, αλλά όχι με το AIM2. Επιπλέον, το συσσωρευτικό σκορ NLRP3 αναγνωρίστηκε ως ένας ευαίσθητος και ειδικός βιοδείκτης για την διάκριση των ασθενών με SS από τα υγιή άτομα. Στα δείγματα ορού αίματος των ασθενών με SS ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος, όπως η IL-1β, η IL-18 και η ASC. Μεταξύ αυτών, τα κυκλοφορούντα επίπεδα της IL-18 και της ASC ανευρέθηκαν σημαντικά αυξημένα σε ασθενείς με σοβαρή νόσο SS, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που είχαν εμφανίσει λέμφωμα NHL. Επιπλέον, τα ορολογικά επίπεδα ASC ήταν σημαντικά υψηλότερα σε ασθενείς με SS που είχαν αναπτύξει λέμφωμα NHL σε σύγκριση με αυτούς χωρίς λέμφωμα και συσχετίστηκαν θετικά με την παρουσία δυσμενών προγνωστικών παραγόντων για την ανάπτυξη λεμφώματος, όπως η παρουσία υποσυμπληρωματιναιμίας C3 και C4 στον ορό του αίματος, ψηλαφητής πορφύρας και λεμφοπενίας. Διαπιστώθηκε ότι τα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος αποτελούν την κύρια πηγή των υψηλών επιπέδων πρωτεϊνών που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος στον ορό του αίματος αυτών των ασθενών, καθώς και ότι είναι αυτά εμφανίζουν ενδείξεις προηγηθείσας ενεργοποίησής τους προς τούτο in vivo (pre-priming). Από την άλλη πλευρά, αναδείχθηκε ότι τα μακροφάγα που διηθούν τους ΕΣΑ ασθενών με σοβαρό SS εμφανίζουν in-situ ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος NLRP3, όπως υποδείχθηκε από την έκφραση σε αυτά υψηλών επιπέδων των πρωτεϊνών NLRP3, ASC και κασπάσης-1, καθώς και της χαρακτηριστικής περιπυρηνικής στικτής συσσώρευσης της πρωτεΐνης ASC (σχηματισμός speck). Επιπλέον, βρέθηκε σημαντική εξωκυττάρια συσσώρευση των ASC specks στις λεμφοκυτταρικές διηθήσεις των σιελογόνων αδένων ασθενών, το οποίο αποτελεί ενδεικτικό στοιχείο για την παρουσία πυρόπτωσης.
Συμπερασματικά, στις μελέτες μας δείξαμε ότι τα μακροφάγα που διηθούν τους σιελογόνους αδένες των ασθενών με SS παρουσιάζουν σημαντική ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος NLRP3 και υψηλή παραγωγή IL-18, η οποία συσχετίζεται σημαντικά με ποικίλους δείκτες αδενικής φλεγμονής, καθώς και με την παρουσία παραγόντων κινδύνου για την ανάπτυξη λεμφώματος NHL στους ασθενείς με SS. Τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν την σημαντική συμμετοχή της IL-18 σε ποικίλες παθολογικές διεργασίες που λαμβάνουν χώρα στα πλαίσια του SS, όπως η επαγωγή και οργάνωση των περιπορικών λεμφο-επιθηλιακών βλαβών, η ανώμαλη έκπτυξη των Β-λεμφοκυτταρικών κλώνων, καθώς και η ανάπτυξη λεμφώματος NHL. Από την άλλη πλευρά, διαπιστώθηκε ότι στους ΕΣΑ των ασθενών με SS, η έκφραση της IL-18 συσχετίζεται αντιστρόφως με αυτή της IL-12, γεγονός που πιθανόν υποδηλώνει αντίθετους ρόλους στις χρόνιες φλεγμονώδεις διεργασίες της νόσου. Επιπλέον, τα μονοκύτταρα περιφερικού αίματος των ασθενών με SS αναγνωρίστηκαν ως η κύρια πηγή κυτταροκινών που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος, όπως η IL-18 και η ASC, που κυκλοφορούν σε αυξημένες ποσότητες στον ορό του αίματος των ασθενών αυτών. Μεταξύ άλλων, τα δεδομένα μας υποδεικνύουν ότι αυτές οι κυκλοφορούσες πρωτεΐνες πιθανότατα αποτελούν προγνωστικοί βιοδείκτες για το νόσημα, όπως υποδεικνύεται από την ισχυρή συσχέτιση τους με τους δείκτες σοβαρότητας αυτού. Συνολικά, τα συμπεράσματά μας καταδεικνύουν ότι η IL-18 και η ενεργοποίηση του φλεγμονοσώματος NLRP3 κατέχουν ρόλο-κλειδί στην παθογένεια των σοβαρών κλινικών εκδηλώσεων του SS, όπως η ανάπτυξη λεμφώματος NHL, γεγονός το οποίο πιθανότατα καθιστά αυτά τα μόρια μελλοντικούς βιολογικούς στόχους για την θεραπευτική αντιμετώπιση του νοσήματος.
