Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Αλέξιος-Λέανδρος Σκαλτσούνης Καθηγητής ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΙΟΝΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΕ ΕΚΠΑ
Σοφία Μητάκου Καθηγήτρια ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΙΟΝΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΕ ΕΚΠΑ
Μαρία Χαλαμπαλάκη Επίκουρη Καθηγήτρια ΤΟΜΕΑΣ ΦΑΡΜΑΚΟΓΝΩΣΙΑΣ ΚΑΙ ΧΗΜΕΙΑΣ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΙΟΝΤΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΕ ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Αντικείμενο μελέτης αποτέλεσε η Χρωματογραφία Κατανομής με Φυγοκέντρηση, η οποία είναι μία σύγχρονη τεχνική για την επεξεργασία και κλασμάτωση πολύπλοκων εκχυλισμάτων και την παραλαβή καθαρών μεταβολιτών, τόσο του πρωτογενή όσο και του δευτερογενή μεταβολισμού των φυτικών οργανισμών. Με την εφαρμογή της τεχνικής αυτής έγινε δυνατή η ανάπτυξη κατάλληλης μεθόδου για την παραλαβή καθαρών μεταβολιτών, ανάλογα τις ιδιότητες του εκχυλίσματος και του μεταβολίτη στόχου.
Επιλέχθηκαν 2 διαφορετικά φυτικά υλικά, η γεντιανή (Gentiana lutea) και η ελιά (Olea europaea), καθώς είναι πλούσια σε βιοδραστικούς μεταβολίτες με αξιοσημείωτες φαρμακολογικές ιδιότητες.
Πρωταρχικός στόχος της διπλωματικής εργασίας ήταν η επεξεργασία του μεθανολικού εκχυλίσματος ρίζας γεντιανής για την γρήγορη και αποτελεσματική απομόνωση του δραστικού μεταβολίτη γεντιοπικροσίδη με την χρήση όσο το δυνατό πιο εξελιγμένων εργαστηριακών μεθόδων. Έτσι, το εκχύλισμα πλούσιο σε γεντιοπικροσίδη αναλύθηκε αρχικά με την μέθοδο C.P.E., ώστε να μειωθεί ο χρόνος επεξεργασίας και προέκυψαν συνολικά 10 εμπλουτισμένα κλάσματα. Η περαιτέρω ανάλυση των εμπλουτισμένων κλασμάτων με την τεχνική παρασκευαστική HPLC οδήγησε στην παραλαβή γεντιοπικροσίδη σε μεγάλη καθαρότητα. Παράλληλα με την υλοποίηση του πρωταρχικού στόχου, επιτεύχθηκε και μια πιο λεπτομερής φυτοχημική ανάλυση του ολικού εκχυλίσματος από την οποία έγινε δυνατή η παραλαβή και ταυτοποίηση 6 κύριων μεταβολιτών του εκχυλίσματος (Γεντισίνη, Ισογεντισίνη, Ισογεντισινη-3-Ο-Πριμεβεροσίδης, Ισογεντισινη-7-Ο-Πριμεβεροσίδης, Σβερτιαμαρίνη και Λογανικό Οξύ).
Εξίσου σημαντικός στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η γρήγορη και αποτελεσματική απομόνωση ολεανολικού και μασλινικού οξέος από προϊόντα ελιάς με την χρήση σύγχρονων χρωματογραφικών μεθόδων. Το ολεανολικό και μασλινικό οξύ αποτελούν δύο βιοδραστικά τριτερπενικά οξέα με πληθώρα βιολογικών δράσεων. Οι διαχωριστικές πορείες ,που επιλέχτηκαν περιλαμβάνουν σαν κύριο στάδιο τη χρήση της Χρωματογραφίας Κατ΄ Αντιρροή με την εφαρμογή της μεθόδου pH-zone refining. Η μέθοδος αυτή εκμεταλλεύεται την όξινη φύση των δύο τριπερπενίων και κυρίως την ιδιότητά τους να μεταβάλουν δραματικά τον συντελεστή κατανομής στις δύο φάσεις ενός διφασικού συστήματος ανάλογα του pH του συστήματος. Το δείγμα, που επιλέχθηκε για την απομόνωση του ολεανολικού οξέος είναι το απολιπασμένο κλάσμα του ακετονικού εκχυλίσματος των φύλλων ελιάς. Το κλάσμα αυτό, πέραν των λιπαρών ενώσεων και των χλωροφυλλών που περιέχει, αποτελεί και πλούσια πηγή ολεανολικού οξέος. Η πορεία διαχωρισμού που επιλέχτηκε περιλαμβάνει αρχικά την επεξεργασία του εκχυλίσματος με ζωικό άνθρακα ώστε να απομακρυνθεί ο μεγάλος όγκος χλωροφυλλών και στη συνέχεια, την ανάλυση του κλάσματος με pH-Zone refining C.P.E., που οδήγησε στην απομόνωση καθαρού ολεανολικού οξέος. Το ολικό πολυφαινολικό κλάσμα του ελαιολάδου περιέχει σημαντικές βιοδραστικές ουσίες διαφόρων χημικών κατηγοριών και είναι πλούσια πηγή σε μασλινικό οξύ. Η διαδικασία απομόνωσης του μασλινικού οξέος από το κλάσμα του ελαιολάδου περιλαμβάνει τη χρήση της Χρωματογραφίας Κατ΄ Αντιρροή με εφαρμογή δύο διαφορετικών μεθόδων. Αρχικά, το εκχύλισμα κλασματώθηκε με dual-mode CPE και στη συνέχεια, το εμπλουτισμένο στον μεταβολίτη, κλάσμα αναλύθηκε με pH-zone refining C.P.E για την παραλαβή καθαρού μεταβολίτη.
Παράλληλα, σημαντικό μέρος διπλωματικής εργασίας αποτέλεσε η ανάλυση του Ολικού Πολυφαινολικού Κλάσματος με την μέθοδο gradient mode C.P.C., όπου εξασφαλίζεται η παραλαβή εμπλουτισμένων κλασμάτων με έντονο χημικό ενδιαφέρον. Η επεξεργασία τριών εξ’ αυτών των κλασμάτων οδήγησε στην απομόνωση τριών νέων μεταβολιτών. Η ανάλυση του κλάσματος 19 με την μέθοδο παρασκευαστική TLC οδήγησε στην απομόνωση μίας ουσίας με παρόμοια χημική δομή με την ολεοκανθάλη, η οποία ταυτοποιήθηκε ως Ολεοκανθαλικό Οξύ. Με παρασκευαστική HPLC αναλύθηκε το κλάσμα 21, από όπου προέκυψε ουσία με παρόμοια δομή με την Ολεασείνη και χαρακτηρίστηκε ως Ολεασεινικό Οξύ. Τέλος, παρόμοια επεξεργάστηκε το κλάσμα 27, που οδήγησε στην απομόνωση του Eda Acid, το οποίο ενώ έχει απομονωθεί από προϊόντα ελαιοτριβείων, είναι η πρώτη φορά που αναφέρθηκε στο ελαιόλαδο.
Τελευταίο πειραματικό κομμάτι της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι ο έλεγχος της αντιοξειδωτικής δράσης των απομονωμένων μεταβολιτών του ελαιολάδου μέσω της εφαρμογής του πρωτοκόλλου DPPH. Από τα αποτελέσματα λήφθηκαν αξιόλογα συμπεράσματα που συνδέουν την εμφάνιση δράσης μίας ουσίας με την ύπαρξη του χαρακτηριστικού δακτυλίου κατεχόλης στο μόριο της.
Λέξεις-κλειδιά:
Χρωματογραφία Κατ' Αντιρροή, Απομόνωση Βιοδραστικών Ουσιών, Γεντιανή, Προιόντα Ελιάς, DPPH
