Characterization of kinases involved in DNA damage response checkpoints after low and high doses of low-LET irradiation and detection of structural DNA variations after induction of complex DNA damage using Nanopore sequencing.

Διπλωματική Εργασία uoadl:2879515 123 Αναγνώσεις

Μονάδα:
Κατεύθυνση Ιατρική Φυσική-Ακτινοφυσική
Βιβλιοθήκη Επιστημών Υγείας
Ημερομηνία κατάθεσης:
2019-07-22
Έτος εκπόνησης:
2019
Συγγραφέας:
Βασιλείου Χριστίνα
Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Αναστάσιος Σιούντας, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΑΠΘ, Επιβλέπων
Αλέξανδρος Γεωργακίλας, Αναπληρωτής Καθηγητής, Σχολή Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών, ΕΜΠ
Γεωργία Τερζούδη, Ερευνήτρια Α΄, ΕΚΕΦΕ "Δημόκριτος"
Πρωτότυπος Τίτλος:
Characterization of kinases involved in DNA damage response checkpoints after low and high doses of low-LET irradiation and detection of structural DNA variations after induction of complex DNA damage using Nanopore sequencing.
Γλώσσες εργασίας:
Αγγλικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
Χαρακτηρισμός κινασών που εμπλέκονται στα σημεία ελέγχου απόκρισης βλαβών DNA μετά από έκθεση σε χαμηλές και υψηλές δόσεις ιοντίζουσας ακτινοβολίας χαμηλού LET και εντοπισμός δομικών αλλοιώσεων μετά απο επαγωγή συνθετων βλαβών DNA με χρήση αλληλούχισης με Nanopore.
Περίληψη:
Αντικαρκινικές θεραπείες, όπως η ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία, δρουν κυρίως προκαλώντας βλάβες στο DNA των καρκινικών κυττάρων. Σε περίπτωση βλάβης του DNA, τα κύτταρα κινητοποιούν ένα πολύπλοκο σύστημα απόκρισης στις βλάβες DNA (DDR) για να αξιολογήσουν το είδος και το επίπεδο των βλαβών και να τις επιδιορθώσουν. Τα διάφορα σημεία ελέγχου στο κυτταρικό κύκλο διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια αυτής της απόκρισης, επομένως η στοχευμένη αναστολή των προαναφερθέντων μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένη θνησιμότητα των καρκινικών κυττάρων και ενδεχομένως σε πιο αποτελεσματικές θεραπείες (Bartek and Lukas, 2001; Iliakis et al., 2003; Jackson and Zhou, 2004).
Στη παρούσα εργασία, χρησιμοποιώντας δεδόμενα που παράγονται από κύτταρα που εκτίθενται σε χαμηλές και υψηλές δόσεις ιοντίζουσας ακτινοβολίας χαμηλού LET, που εισάγουν χαμηλό αριθμό δίκλωνων θραύσεων στο γονιδίωμα, επιβεβαιώνουμε τη ρύθμιση του σημείου ελέγχου G2/M κυρίως μέσω των κινασών ATR και ATM (αποτελέσματα που δημοσιεύθηκαν αρχικά από τους (Mladenov et al., 2019)). Παρέχουμε επίσης αποδείξεις ότι αυτές οι κινάσες αλληλεπιδρούν με το κυτταρικό κύκλο κυρίως μέσω της κινάσης Chk1. Στις υψηλές δόσεις παρουσιάζουμε προκαταρκτικά αποτελέσματα του κυρίαρχου ρόλου του Chk1 στην εποπτεία των σημείων ελέγχου.
Μεγαλύτερος αριθμός δίκλωνων θραύσεων είναι γνωστό ότι προκαλεί ακόμα πιο σοβαρή κυτταρική βλάβη (Khanna and Jackson, 2001; van Gent et al., 2001). Ένας από τους παράγοντες επαγωγής πολλαπλών δίκλωνων θραύσεων (DSBs) θεωρείται ότι είναι ιοντίζουσα ακτινοβολία υψηλού LET. Ένα από τα χαρακτηριστικά της ακτινοβολίας υψηλού LET είναι η εισαγωγή στο γονιδίωμα σύνθετων αλλοιώσεων. Αυτή η πολυπλοκότητα παραδοσιακά θεωρείται ότι είναι ο συνδυασμός αλλοιώσεων χαμηλότερου επιπέδου όπως βλάβες της μίας αλυσίδας, μεταβολές ή απώλειες βάσης, θραύσεις μονής έλικας, δίκλωνες θραύσεις κλπ ή συνδυασμός των προαναφερθέντων τύπων βλαβών. Ο συνδυασμός των αλλοιώσεων χαμηλού επιπέδου με δίκλωνες θραύσεις αποτελεί τη κύρια απειλή για την ακεραιότητα του γονιδιώματος σύμφωνα με τη βιβλιογραφία (Campa et al., 2005, Gupta et al., 2009, Seluanov et al., 2010). Εδώ χρησιμοποιούμε ένα μοντέλο που βασίζεται στην υπόθεση ότι η αυξανόμενη πολυπλοκότητα της βλάβης του DNA προκύπτει από τη συνεγκατάσταση ή το συνδυασμό αυξημένου αριθμού DSBs σε ένα σχετικά μικρό εύρος αλληλουχίας (Iliakis et al., 2018; Mladenova et al., 2016).
Οι κυτταρικοί κλώνοι που χρησιμοποιήθηκαν για αυτό το τμήμα της ανάλυσης προέρχονται από άνθρωπο και χάμστερ και δημιουργήθηκαν με σκοπό να μοντελοποιήσουν τις σύνθετες βλάβες DNA επαγόμενες μόνο από τις δίκλωνες θραύσεις DNA. Περιέχουν πολλαπλές γενετικά τροποποιημένες αλληλουχίες που δημιουργήθηκαν με τη βοήθεια πλασμιδιακού DNA κατασκευασμένες μέσω κατάλληλων θέσεων αναγνώρισης της μεγανουκλεάσης I-SceI , επακόλουθη έκφραση του ενζύμου προκαλεί διαφορετικό αριθμό DSBs σε προκαθορισμένες γεννετικές θέσεις. Έτσι, παρέχεται η δυνατότητα ποσοτικοποίησης της επίδρασης πολλαπλών DSBs σε ένα σχετικά μικρό τμήμα μιας αλληλουχίας και ταυτόχρονα εξαιρούνται άλλες μεταβλητές και άλλου τύπου βλάβες που εισέρχονται όταν χρησιμοποιείται ιοντίζουσα ακτινοβολία υψηλού LET. Ένας χαρακτηρισμός αυτών των κλώνων πραγματοποιήθηκε υλοποιώντας αλληλούχιση του DNA στην πλατφόρμα MinION από την ONT. Ο εντοπισμός και η ταυτοποίηση των θέσεων της I-SceI παρουσιάζεται ταυτόχρονα και σε κλώνους χάμστερ και σε ανθρώπινους. Επιπροσθέτως προτείνουμε ένα καινοτόμο μοντέλο για τη μελέτη επαγόμενων δομικών αλλοιώσεων. Τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν περισσότερες τοποθεσίες ενσωμάτωσης της γενετικά τροποποιημένης αλληλουχίας σε σύγκριση με άλλες τεχνικές. Επιπλέον, στα αποτελέσματα της ανάλυσής μας, ήταν εμφανής η υποβάθμιση της λειτουργίας επιδιόρθωσης και αποκατάστασης των δίκλωνων θραύσεων καθώς και ο αυξημένες μετατοπίσεις σε τμήματα του γονιδιώματος.
Κύρια θεματική κατηγορία:
Επιστήμες Υγείας
Λέξεις-κλειδιά:
Ιοντίζουσα ακτινοβολία, Σύνθετες βλάβες DNA, Σύστημα απόκρισης στις βλάβες DNA, Χαμηλές δόσεις, Υψηλές δόσεις, Αλληλούχιση, Nanopore, MinION, ONT, Βιοπληροφορική, Υψηλό LET, Χαμηλό LET, ATM, ATR, Chk1, Chk2, G2 σημείο ελέγχου, Κυτταρικός κύκλος
Ευρετήριο:
Ναι
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
2
Εικονογραφημένη:
Ναι
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
65
Αριθμός σελίδων:
82
Master thesis_Vasileiou(1).pdf (2 MB) Άνοιγμα σε νέο παράθυρο