Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Παναγούλα Κόλλια, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Μοριακής Γενετικής Ανθρώπου, ΕΚΠΑ
Διονύσιος Σγούρας, Διευθυντής Ερευνών, Εργαστήριο Ιατρικής Μικροβιολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Ισιδώρα Σ. Παπασιδέρη, Καθηγήτρια Κυτταρικής & Αναπτυξιακής Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Το Ελικοβακτήριο του πυλωρού (H. pylori) αποτελεί κύριο αιτιολογικό παράγοντα για την εκδήλωση μια σειράς παθήσεων, όπως η χρόνια ενεργός γαστρίτιδα και το πεπτικό έλκος και αυξάνει κατακόρυφα τον κίνδυνο για την ανάπτυξη γαστρικού καρκίνου, η εκρίζωσή του δε, αποτελεί προτεραιότητα του Παγκόσμιου Οργανισμού γείας, λόγω της αυξητικής τάσης της αντοχής του στα αντιβιοτικά. Στην Ελλάδα, πολυκεντρική μελέτη της περιόδου 2012-2015 που πραγματοποιήθηκε από το Ε. Ι. Παστέρ, ανέδειξε την έκταση του φαινομένου, αποκαλύπτοντας τα υψηλά επίπεδα αντοχής του H. pylori στην κλαριθρομυκίνη (27,2%), στη μετρονιδαζόλη (32,1%) και τη λεβοφλοξασίνη (7,7-8,2%). Στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας, πραγματοποιήθηκε βιοπληροφορική ανάλυση δεδομένων Ανάγνωσης Αλληλουχίας Πλήρους Γονιδιώματος (WGS) με στόχο τη μελέτη της γενετικής βάσης του μηχανισμού αντοχής. Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν 38 κλινικά στελέχη H. pylori τα οποία είχαν ήδη χαρακτηριστεί αναφορικά με την ευαισθησία τους στα προαναφερθέντα αντιβιοτικά με φαινοτυπική διαδικασία προσδιορισμού (E-test).
Πραγματοποιήθηκε σύγκριση των αλληλουχιών 6 γονιδίων σχετιζόμενων με την αντοχή
στην κλαριθρομυκίνη (23S rRNA), τη μετρονιδαζόλη (rdxA, frxA, rpsU) και τη λεβοφλοξασίνη (gyrA, gyrB), με τα αντίστοιχα γονίδια του στελέχους αναφοράς H. pylori 26695.
Καταγράφηκε η παρουσία πλαισιοτροποποιητικών αλλαγών (ελλείψεων και προσθηκών)
και σημειακών μεταλλάξεων, που είτε έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση διαφορετικού αμινοξικού καταλοίπου στην πολυπεπτιδική αλυσίδα που συντίθεται, είτε είναι σιωπηλές και η ανάλυση ολοκληρώθηκε με εφαρμογή στατιστικής δοκιμασίας για την αξιολόγηση της
παρουσίας των μεταλλάξεων σε ανθεκτικά και ευαίσθητα στο εκάστοτε αντιβιοτικό,
στελέχη.
Αναφέρονται μεταλλάξεις που έχουν ήδη σχετιστεί με την ανάπτυξη αντοχής σε
συγκεκριμένο αντιβιοτικό, οι οποίες θεωρούνται χαρακτηριστικές και συχνά εμφανιζόμενες
και το γεγονός αυτό επιβεβαιώνεται και από τα ευρήματά μας. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον
παρουσιάζει ωστόσο η περίπτωση μεταλλάξεων που βιβλιογραφικά αναφέρονται ως
υπεύθυνες για την αντοχή και οι οποίες στην παρούσα μελέτη, εντοπίστηκαν και σε
ευαίσθητα στελέχη, ενώ περαιτέρω ανάλυσης σε μεγαλύτερο αριθμό στελεχών χρήζουν και
οι μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν αποκλειστικά ή κατά κύριο λόγο σε ανθεκτικά στελέχη, η
παρουσία των οποίων όμως δεν έχει σχετιστεί άμεσα με το φαινόμενο αντοχής του H. pylori
3
στα αντιβιοτικά. Σημειώνεται, ακόμη, ότι στους πίνακες καταγραφής των μεταλλάξεων
υπάρχει ένα σύνολο θέσεων στη νουκλεοτιδική αλληλουχία των γονιδίων με παρουσία
συγκεκριμένων αζωτούχων βάσεων, οι οποίες είναι ίδιες στην πλειοψηφία ή ακόμη και στο
σύνολο των στελεχών και διαφορετικές από αυτές που καταγράφονται στο στέλεχος
αναφοράς. Η ύπαρξη αυτών των πολυμορφικών θέσεων είναι αναμενόμενη, καθώς το H.
pylori διαθέτει εξαιρετική πολυμορφικότητα, απόρροια του αντίξοου περιβάλλοντος στο
οποίο επιβιώνει και στην πλειοψηφία τους δεν αναφέρονται στη βιβλιογραφία ως
σχετιζόμενες με την αντοχή στα αντιβιοτικά.
Η τεχνολογία Ανάγνωσης Αλληλουχίας Πλήρους Γονιδιώματος (WGS) έχει συνεισφέρει
σημαντικά στη μελέτη οργανισμών, όπως το H. pylori, η εκρίζωση του οποίου αποτελεί
ζήτημα δημόσιας υγείας, λόγω της διαρκώς αυξανόμενης αντοχής έναντι των αντιβιοτικών.
Η αξιοποίηση των δυνατοτήτων και των πλεονεκτημάτων της μεθόδου, καθιστά δυνατή τη
μελέτη οργανισμών σε επίπεδο γονιδιώματος, ενώ παράλληλα εξασφαλίζει την
αποδέσμευση από παραδοσιακές τεχνικές καλλιέργειας. Μάλιστα, παρέχει τη δυνατότητα
πολλαπλού χειρισμού των δεδομένων, ανάλογα με τις ανάγκες της εκάστοτε μελέτης και
εξαγωγής συμπερασμάτων χρήσιμων στην κλινική πράξη, τα οποία αφορούν
παραδείγματος χάρη, ζητήματα παθογένειας ή αντοχής στα αντιβιοτικά. Παρά τα πολλαπλά
οφέλη από την εκμετάλλευση της τεχνολογίας WGS, υπάρχουν φραγμοί στην εδραίωση της
στη διαγνωστική ρουτίνα των μικροβιολογικών εργαστηρίων. Ο χρόνος διεκπεραίωσης των
αναλύσεων και αξιολόγησης των αποτελεσμάτων, καθώς και η ανάγκη για προσαρμογή της
ροής εργασίας, αποτελούν χαρακτηριστικά εμπόδια. Κι αυτό, διότι διαχρονικά αποτελεί
αναγκαιότητα η μείωση του απαιτούμενου χρονικού διαστήματος για την ολοκλήρωση των
διαδικασιών, ώστε να μην ξεπερνά το χρόνο των παραδοσιακών αναλύσεων. Επιπλέον,
τίθενται ζητήματα εκπαίδευσης και κατάρτισης του επιστημονικού δυναμικού για την
εξοικείωση όχι μόνο με το πειραματικό μέρος, αλλά και τη βιοπληροφορική ανάλυση, που
έπεται αυτού. Τέλος, προβληματισμοί εγείρονται γύρω από την ασυμφωνία των
αποτελεσμάτων φαινοτυπικής και γονοτυπικής ανίχνευσης της αντοχής στα αντιβιοτικά, με
τη δεύτερη μέθοδο να προσδιορίζεται ως καταλληλότερη για την περίπτωση αντιβιοτικών,
η αντοχή έναντι των οποίων έχει συνδεθεί με καλά χαρακτηρισμένες μεταλλάξεις.
