Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ιωάννης Τρουγκάκος, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Αθηνών
Περίληψη:
Τα μικρογλοιακά κύτταρα αποτελούν τα ανοσιακά κύτταρα του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ), που επιτελούν σημαντικούς ρόλους στην ανάπτυξη των νευρικών κυκλωμάτων του αναπτυσσόμενου εγκεφαλικού ιστού αλλά και στην ομοιόσταση του ενήλικου εγκεφάλου. Στον υγιή εγκέφαλο, έχουν μια άκρως διακλαδιζόμενη μορφολογία και βρίσκονται σε διαρκή κίνηση με το να επεκτείνουν και να αποσύρουν τις προεκβολές τους, ένα είδος μικρογλοιακής κινητικότητας που όπως πρόσφατα δείχθηκε, ρυθμίζεται από την τονική δραστικότητα του διαύλου καλίου THIK-1. Υπό παθολογικές καταστάσεις, όπως ιστική βλάβη, νόσο ή μόλυνση του εγκεφαλικού ιστού, η μικρογλοία ρυθμίζει την υπερέκφραση αρκετών επιφανειακών υποδοχέων όπως οι MHCII και A2A και η μορφολογία της γίνεται λιγότερο διακλαδισμένη, με βραχύτερες προεκβολές και μεγαλύτερα σώματα.
Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ανάπτυξη υπολογιστικών μεθόδων για την ανάλυση της μορφολογίας και της κινητικότητας της μικρογλοίας στον εγκέφαλο και το νωτιαίο μυελό ποντικών με νευροεκφυλιστική ασθένεια. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η δυναμική της μικρογλοίας σε διαφορετικά στάδια ενός πειραματικού μοντέλου της Σκλήρυνσης Κατά Πλάκας (ΣΚΠ), αυτό της Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλομυελίτιδας (ΠAE). Η μελέτη επικεντρώθηκε σε τρεις περιοχές της φαιάς ουσίας του εγκεφάλου και πιο συγκεκριμένα στο φλοιό, τον ιππόκαμπο και την παρεγκεφαλίδα αλλά και στην οσφυϊκή περιοχή του νωτιαίου μυελού. Αρχικά, με τη χρήση C57BL/6 ποντικών και συνεστιακής μικροσκοπίας, απεικονίστηκε η μορφολογία και αναλύθηκαν τα χαρακτηριστικά των μικρογλοιακών κυττάρων σε υγιείς εγκεφαλικούς ιστούς αλλά και σε εγκεφαλικούς ιστούς ποντικών που βρίσκονται σε διάφορα στάδια εξέλιξης της ΠΑΕ. Στη συνέχεια, με τη χρήση μικροσκοπίας δύο φωτονίων και τεχνικών κρανιακού παραθύρου σε γονιδιακά σημασμένους ποντικούς αναφοράς (CX3CR1-GFP) καταγράφηκε η κινητικότητα της μικρογλοίας στον υγιή εγκέφαλο αναισθητοποιημένων ποντικών αλλά και κατά τη διάρκεια της εξέλιξης της νόσου. Τα δεδομένα βιο-απεικόνισης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας εργαλεία ανάλυσης εικόνας υψηλής απόδοσης, συμπεριλαμβανομένων των ΙmageJ2/Fiji και Imaris. Σχεδιάστηκαν υπολογιστικά πρωτόκολλα προ-επεξεργασίας και ανάλυσης των εικόνων, για τα οποία αναπτύχθηκαν επιπρόσθετα προγράμματα μακροεντολών (scripts) που ενσωματώθηκαν στα εργαλεία. Τέλος, χρησιμοποιήθηκαν οι γλώσσες προγραμματισμού Java και Matlab για να αναπτυχθεί μια ειδική εφαρμογή (MicroApp) για την επεξεργασία των δεδομένων εικόνας του συνεστιακού μικροσκοπίου που χρησιμοποιήθηκαν για την αυτοματοποιημένη υπολογιστική ανάλυση της μικρογλοιακής μορφολογίας.
H αυτόματη υπολογιστική μέθοδος που αναπτύχθηκε επέτρεψε την επεξεργασία πολύ μεγάλου όγκου δεδομένων, παρέχοντας έτσι για πρώτη φορά τη δυνατότητα ανάλυσης της μικρογλοιακής δυναμικής και μορφολογίας για όλα τα χρονικά στάδια της ΠΑΕ και, ταυτόχρονα, για διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου. Από τα αποτελέσματα προέκυψε αρχικά ότι η μορφολογία των μικρογλοιακών κυττάρων μεταβάλλεται με διαφορετικό τρόπο και σε διαφορετικά χρονικά σημεία για κάθε περιοχή του εγκεφάλου κατά την ΠΑΕ, δείχνοντας έτσι μια τοπολογική εξειδίκευση της απόκρισης της μικρογλοίας σε παθολογικά ερεθίσματα. Από την μορφολογική εξέταση προέκυψε επίσης ότι η περιοχή του εγκεφάλου όπου η μικρογλοία επηρεάζεται γρηγορότερα κατά την ΠΑΕ είναι η παρεγκεφαλίδα, ήδη από την προκλινική φάση της νόσου. Τα αποτελέσματα αυτά εγείρουν το ενδιαφέρον της συγκεκριμένης περιοχής ως μελλοντικό στόχο έρευνας για τον μηχανισμό λειτουργίας της ΠΑΕ, κάτι που έως τώρα δεν έχει μελετηθεί διεξοδικά. Τέλος, τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής δείχνουν μια σαφή μείωση της κινητικότητας των προεκβολών της μικρογλοίας και της επιτήρησης του εγκεφάλου που αυτή επιτελεί στο φλοιό του εγκεφάλου στην κλινική φάση της ΠΑΕ, με μελλοντικό στόχο να πραγματοποιηθεί η αντίστοιχη μελέτη και στην περιοχή της παρεγκεφαλίδας και σε προγενέστερα προ-κλινικά σημεία της νόσου.
Η μεταπτυχιακή εργασία διεξήχθη υπό την επίβλεψη της μεταδιδακτορικής ερευνήτριας Δρ. Βασιλικής Κυραργύρη στο πλαίσιο του προγράμματος του ΕΛ.ΙΔ.Ε.Κ. «Microglia-driven pathology and altered surveillance in demyelination» με κωδικό Πράξης 1156, σε συνεργασία με το Εργαστήριο Μοριακής Γενετικής (επιστημονική υπεύθυνη εργαστηρίου: Δρ. Lesley Probert) στο Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ (ΕΙΠ).
Λέξεις-κλειδιά:
βιοπληροφορική, εγκέφαλος, μικρογλοιακά κύτταρα, Σκλήρυνση Κατά Πλάκας, Κεντρικό Νευρικό Σύστημα, παρεγκεφαλίδα, Πειραματική Αυτοάνοση Εγκεφαλομυελίτιδα
