Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Δ. Ι. Στραβοπόδης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.
Π. Κόλλια, Αναπλ. Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α
Ι.Σ. Παπασιδέρη, Καθηγήτρια, Τμημα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α
Περίληψη:
Η οικογένεια των Αργοναυτών εμφανίζει υψηλό βαθμό συντηρητικότητας, με τα μέλη της να απαντώνται στα Αρχαία, στους Προκαρυωτικούς και Ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Η συγκεκριμένη οικογένεια υποδιαιρείται σε τρείς υποοικογένειες, όπως αυτές κατάγραφονται παρακάτω: την υποοικογένεια AGO, η οποία περιλαμβάνει πρωτεΐνες όπως η AGO1 που ανακαλύφθηκε στο φυτό Arapidopsis thaliana, την υποοικογένεια PIWI (P element induced wimpy testis), η οποία αποτελείται από πρωτεΐνες όπως η πρωτεΐνη piwi που βρέθηκε στον οργανισμό Drosophila melanogaster και τέλος, την πρόσφατη υποοικογένεια Αργοναύτη 3 που περιλαμβάνει πρωτεΐνες όμοιες με εκείνες του οργανισμού C. elegans. Οι πρωτεΐνες Αργοναύτες έχουν χαρακτηριστική δίλοβη δομή. Ο ένας λοβός συγκροτείται από τις επικράτειες N-PAZ και ο άλλος από τις MID-PIWI, σχηματίζοντας στο κέντρο της πρωτεΐνης μία ειδική θέση πρόσδεσης μικρών μορίων RNA. Οι πρωτεΐνες της συγκεκριμένης οικογένειας φαίνεται να εμπλέκονται σε πολλές διαδικασίες του κυττάρου, όπως στη βιογένεση των μικρών RNA, microRNA, small-interference RNA και piwi-interacting RNA. Οι πρωτεΐνες Αργοναύτες απαντώνται κυρίως στο κυτταρόπλασμα (συνήθως στα σωματίδια P-bodies), αν και πρόσφατες μελέτες έχουν εντοπίσει τα συγκεκριμένα μόρια μέσα στο πυρήνα. Από την οικογένεια των αργοναυτών, ο Αργοναύτης 2 διαθέτει καταλυτική υπομονάδα (λόγω του ιδιαίτερου μοτίβου Asp597-Asp669-His807 που εμφανίζει στη δομή του) και εμπλέκεται στην μετα-μεταγραφική ρύθμιση ως μέλος του συμπλόκου RISC με διάφορους τρόπους. Είτε καταστρέφοντας το προσδεδεμένο mRNA, είτε εμποδίζοντας την μετέπειτα μετάφραση του. Επίσης, φαίνεται ότι η συγκεκριμένη πρωτεΐνη εμπλέκεται σε πολλά σύνδρομα και ασθένειες, όπως για παράδειγμα σε διάφορους τύπους καρκίνου και στο σύνδρομο Εύθραστου Χ. Για τον σκοπό αυτό, στην παρούσα εργασία, μελετάται η επίδραση που έχει η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Αργοναύτης 2 στον φαινότυπο των φυσιολογικών θυρεοειδικών κυττάρων ΝΤΗΥ. Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Αργοναύτης 2 πραγματοποιήθηκε μέσω της διαδικασίας της διαμόλυνσης κυττάρων με πλασμιδιακούς φορείς (AGO2-GFP πλασμίδιο και GFP πλασμίδιο). Η μέθοδος της κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι τα κύτταρα που εκφράζουν την χιμαιρική πρωτεΐνη Αργοναύτης 2-gfp είναι λιγότερα συγκριτικά με εκείνα που εκφράζουν μόνο το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας χρωστικής. Περαιτέρω ανάλυση πραγματοποιήθηκε μέσω της δοκιμασίας ΜΤΤ κατά την οποία παρατηρήθηκε ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Ago2 σε κύτταρα μειώνει τον αρχικό πληθυσμό των βιώσιμων κυττάρων. Επιπλέον, μελετήθηκε η μεταγραφική έκφραση διαφόρων γονιδίων ενδιαφέροντος σε κύτταρα τα οποία είχαν προσλάβει το πλασμίδιο της πρωτεΐνης Αργοναύτης 2-gfp, μέσω της δοκιμασίας αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Ago2 φαίνεται να μην επηρεάζει την συνολική μεταγραφική έκφραση των γονιδίων ελέγχου LamA/C, GAPDH ή των μελών της οικογένειας των Aργοναυτών. Αντίθετα, η ενδογενής έκφραση του γονιδίου του Αργοναύτη 2 σε μεταγραφικό επίπεδο στον κυτταρικό πληθυσμό που υπερεκφράζει την πρωτεΐνη Αgo2, δείχνει να έχει πτωτική τάση συγκριτικά με την έκφραση που παρουσιάζεται στα κύτταρα που εκφράζουν μόνο την πράσινη φθορίζουσα χρωστική GFP. Επιπρόσθετα, μέσω της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (q-PCR) παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα που προσέλαβαν μόνο το γονίδιο της πράσινης χρωστικής GFP, εμφανίζουν μεγαλύτερο φθορισμό συγκριτικά με εκείνα που προσέλαβαν το πλασμίδιο του Αργοναύτη 2. Τέλος, η έκφραση των μελών της οικογένειας των αργοναυτών (AGO1, AGO2, AGO3, AGO4) φαίνεται ότι παρουσιάζει διαφορές στην μεταγραφική έκφραση ανάμεσα στους διάφορους κυτταρικούς πληθυσμούς που μελετήθηκαν.
