Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Σίδερης Διαμάντης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Σκορίλας Ανδρέας, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό Καποδιστριακό
Πανεπιστήμιο Αθηνών
Κοντός Χρήστος, Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό Καποδιστριακό
Πανεπιστήμιο Αθηνών
Περίληψη:
Εισαγωγή: Η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία είναι μία κακοήθης διαταραχή που χαρακτηρίζεται από τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό και τη συσσώρευση των B λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα, το μυελό των οστών, τους δευτερεύοντες λεμφοειδείς ιστούς και το σπλήνα. Αποτελεί την πιο κοινή μορφή λευχαιμίας σε ενήλικα άτομα στις δυτικές χώρες. Η διάγνωση της νόσου μπορεί να πραγματοποιηθεί με απλές εξετάσεις αίματος, παρόλα αυτά είναι ακόμη σημαντική η εύρεση νέων δεικτών για την όσο το δυνατόν πιο έγκαιρη διάγνωση της νόσου. Επιπλέον, ένα από τα βασικά προβλήματα στην θεραπευτική αντιμετώπιση της ΧΛΛ, είναι η επιλογή της κατάλληλης θεραπείας, κάτι που μπορεί εύκολα να πραγματοποιηθεί με την εύρεση προγνωστικών δεικτών που θα δίνουν πληροφορία σχετικά με την ολική επιβίωση των ασθενών. Τα microRNAs είναι ενδογενή μη κωδικά μικρά μόρια RNA που έχουν αρκετούς σημαντικούς ρυθμιστικούς ρόλους και λειτουργίες στα κύτταρα. Η κατανόηση της λειτουργίας των miRNAs στην ογκογένεση μπορεί να δώσει πληροφορίες για τα βασικά ερωτήματα που ακόμη υπάρχουν στην έρευνα για τον καρκίνο. Όλο και περισσότερα στοιχεία υποδηλώνουν ότι μεγάλων αριθμός microRNAs στην παθογένεια της ΧΛΛ. Σκοπός: Οι βασικοί στόχοι αυτής της διπλωματικής εργασίας ήταν: ο ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης των microRNA-451a, microRNA-4865p και microRNA-582-5p σε ασθενείς με Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία, μέσω της διαδικασίας της Real-Time q-PCR, η επιβεβαίωση ή όχι της συσχέτισης τους με υπερέκφραση ή υποέκφραση, σε σχέση με υγιή άτομα, αλλά και μεταξύ των ασθενών, σε σύγκριση με την ολική επιβίωση, και τα διάφορα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά τους και, εν τέλει, η εκτίμηση της πιθανής κλινικής σημασίας των συγκεκριμένων microRNAs ώς διαγνωστικοί ή προγνωστικοί βιοδείκτες. Μέθοδοι: Στα πλαίσια της παρούσας διπλωματικής εργασίας, πραγματοποιήθηκε διαχωρισμός των μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMCs) με Ficoll από 82 δείγματα ασθενών με Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία και 29 Υγιών Ατόμων και στην πορεία ακολούθησε απομόνωση ολικού RNA από τα κύτταρα αυτά, με τη χρήση TRI REAGENT και φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός της συγκέντρωσης του απομονωμένου Ολικού RNA. Στη συνέχεια έγινε σχεδιασμός εκκινητών για τα microRNA 451a, 486-5p και 582-5p που αποφασίστηκε να μελετηθούν και σύνθεση cDNA με τη διαδικασία της PCR Αντίστροφης Μεταγραφής με ένα αρχικό στάδιο Πολυαδενυλίωσης (PAP RT-PCR). Τέλος, πραγματοποιήθηκε ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης των συγκεκριμένων microRNAs στα δείγματα αυτά με την διαδικασία της PCR Πραγματικού Χρόνου(Real-Time qPCR) και ακολούθησε Στατιστική Ανάλυση, όπου εξετάστηκε, με τη χρήση διαφόρων στατιστικών test, η συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης στα συγκεκριμένα microRNA, μεταξύ ασθενών με ΧΛΛ και υγιών ατόμων, καθώς και μεταξύ των διαφόρων κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών των ασθενών, αλλά και η ολική επιβίωση(OS) των ασθενών, σε σχέση με τα microRNA-451a , microRNA-486-5p και microRNA-582-5p. Αποτελέσματα & Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα των πειραματικών διαδικασιών που πραγματοποιήθηκαν, αρχικά βοήθησαν στον ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των συγκεκριμένων microRNAs στα δείγματα ασθενών με ΧΛΛ αλλά και υγειών. Η συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης στα συγκεκριμένα microRNAs, μεταξύ ασθενών με ΧΛΛ και υγιών ατόμων, έδειξε ότι τα επίπεδα έκφρασης στα τρία microRNAs εμφανίζουν διαφορά σε σχέση με τα υγιή άτομα, που ήταν στατιστικά σημαντική (p<0,05). Η συσχέτιση των τριών microRNAs σε σχέση με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών με ΧΛΛ, έδειξε ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ του microRNA-582-5p και του κλασσικού δείκτη πρόγνωσης CD38 αλλά και της κλινικής σταδιοποίησης Rai. Τέλος, η ολική επιβίωση των ασθενών με ΧΛΛ σε σχέση με τα τρία microRNAs, ορίζοντας ένα βέλτιστο όριο cut-off, έδειξε ότι και στα τρία microRNAs, οι θετικοί και αρνητικοί ασθενείς (σύμφωνα με το όριο cut-off), δεν φαίνεται να εμφανίζουν ουσιαστική διαφορά, μη δίνοντας στατιστικά σημαντικά αποτελέσματα σχετικά με την ολική επιβίωση(p>0,05).
Λέξεις-κλειδιά:
microRNAs, Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία, ΧΛΛ, Μονοπύρηνα κύτταρα αίματος
