Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Διαμάντης Σίδερης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Σκορίλας Ανδρέας, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Κοντός Χρήστος, Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Η οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία (ΟΛΛ) είναι μια μορφή κακοήθειας των λεμφοκυττάρων. Χαρακτηρίζεται από τη συσσώρευση ανώριμων κυττάρων αίματος στο μυελό των οστών. Η οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία αποτελεί μία από τις πιο σημαντικές κακοήθεις νόσους της παιδικής ηλικίας, με τη μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης να παρουσιάζεται μεταξύ των παιδιών ηλικίας 2 και 5 ετών. Διαχρονικά, η ΟΛΛ αποτελεί πεδίο έρευνας για αυτό και υπάρχουν αρκετοί δείκτες, που χρησιμοποιούνται για τη διάγνωση και τη διαφοροδιάγνωσή της. Οι ριβονουκλεάσες, που τα τελευταία χρόνια έχει αποδειχτεί η συμμετοχή τους σε πολλές περιπτώσεις καρκινογένεσης ανήκουν στην κατηγορία των νουκλεασών, μόρια που αποικοδομούν δηλαδή τα RNAs σε μικρότερα τμήματα. Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας είναι η αύξηση του αριθμού των δειγμάτων και η συνέχιση της μελέτης των επιπέδων έκφρασης των μεταγράφων 1, 4, και 14 αλλά και η εκ νέου μελέτη των μεταγράφων 9 και 19 του γονιδίου της ριβονουκλεάσης κ, σε περιπτώσεις ασθενών με παιδική ΟΛΛ. Συνολικά μελετήθηκαν 70 ασθενείς με παιδική ΟΛΛ, από τους οποίους απομονώθηκε ολικό RNAαπό δείγματα μυελού (ολικό αίμα) και συντέθηκε cDNAμε την αντίδραση της RT-PCR. Η μελέτη των επιπέδων έκφρασης των 5 μεταγράφων πραγματοποιήθηκε με ανάλυση Real-Time PCR, με τη χρήση της χρωστικής SYBR-GREEN και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων για τη συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης με διάφορα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών.
Τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης αποδεικνύουν ότι τα επίπεδα έκφρασης των τριών μεταγράφων (1,4 και 14) είναι μειωμένα στους ασθενείς σε σχέση με τους υγιείς (pclas<0,001, pv4<0,001, pv14<0,001), ενώ αντίστοιχα για τα ζεύγη των ασθενών μεταξύ της ημέρας διάγνωσης και της 33ης ημέρας, δεν εμφανίζονται μεγάλες διαφορές στα επίπεδα έκφρασης στο τέλος της θεραπείας εφόδου(pclas=0,614, pv4=0,627 pv14=0,548). Όσον αφορά το κλασικό μετάγραφο, παρουσιάζει αυξημένη έκφραση παρουσία δυσμενών δεικτών, όπως ο φαινότυπος B-ΟΛΛ και Τ-ΟΛΛ (pclas=0,366), ο αριθμός λευκών WBC>50.000 cells/μL (pclas=0,032), η απουσία υπερδιπλοειδίας (pclas=0,048). Επιπλέον στις περιπτώσεις θετικής MRD και ασθενών υψηλού κινδύνου, το μετάγραφο 1 παρουσιάζει ελαφρώς μια αυξημένη έκφραση με pclas=0,185 και pclas=0,191 αντίστοιχα. Η ανάλυση επιβίωσης Kaplan Meier και η Cox regression ανάλυση παλινδρόμησης δείχνουν ότι όσοι ασθενείς υπερεκφράζουν το κλασικό μετάγραφο εμφανίζουν αυξημένο κίνδυνο θανάτου (HR=1,908 με p=0,293 και διάστημα εμπιστοσύνης 95%: 0,573-6,357).Αντίστοιχα τα μετάγραφα 4 και 14, παρότι δεν έχουν παρουσιάσει κάποια σταστιστικά σημαντική συσχέτιση με τους παραπάνω δείκτες, αξίζει να σημειωθεί το γεγονός ότι οι ασθενείς με θετική MRD την 15η μέρα είχαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης του var. 4, p=0,064, αποτέλεσμα μεγάλη τάση σημαντικότητας. Ωστόσο οι ίδιοι ασθενείς δεν είχαν αυξημένα επίπεδα και του vr.14 (p=0,852). Βάσει του Danger Score, το variant 14 της RNase K φαίνεται να έχει αυξημένη έκφραση, με αυξημένη τάση σημαντικότητας (p=0,079), για τους ασθενείς υψηλού κινδύνου (high risk), κάτι που δεν παρατηρήθηκε όμως και για το 4 (p=0,807). Γενικά όμως, φαίνεται ότι τα μετάγραφα 4 και 14 ακολουθούν παρόμοιο μοτίβο έκφρασης συγκριτικά με τα κλινικοπαθολογικά δεδομένα των ασθενών, το οποίο αποδεικνύεται και από την ανάλυση συσχέτισης κατά Spearman (RS=0,695, p<0,001). Συνολικά, για το μετάγραφο 19 εξετάσθηκαν 31 ασθενείς, η έκφραση του οποίου εξετάστηκε ως προς την ηλικία των ασθενών και τον αριθμό λευκών κυττάρων την ημέρα της διάγνωσης. Οι ασθενείς ηλικίας άνω των 10 ετών εμφάνισαν αυξημένη έκφραση του μεταγράφου 19, αποτέλεσμα στατιστικά σημαντικό (p= 0,039). Επιπλέον, όσοι ασθενείς παρουσίασαν την ημέρα διάγνωσής τους αριθμό λευκών κυττάρων (WBC) μεγαλύτερο των 50000, εμφάνισαν επίσης αυξημένα επίπεδα του μεταγράφου 19, αποτέλεσμα με μεγάλη τάση σημαντικότητας (p= 0,076). Όσον αφορά τη μελέτη του μεταγράφου 9, παρατηρήθηκαν πολλαπλές καμπύλες αποδιάταξης, που υποδεικνύουν την ύπαρξη και παραπροϊόντων εκτός από το μετάγραφο 9. Σε όσους ασθενείς εξετάστηκε, το αποτέλεσμα ήταν το ίδιο. Σε κάθε περίπτωση, τα αποτελέσματα απαιτούν αποσαφήνιση με Sequencing.
Συμπερασματικά, τα επίπεδα έκφρασης των μεταγράφων 1 και 19 φαίνεται να έχουν μια σοβαρή συσχέτιση με κακούς προγνωστικούς δείκτες για την ΟΛΛ. Το κλασικό μετάγραφο μπορεί επίσης να παρέχει πληροφορίες ως προς την ολική επιβίωση. Όσον αφορά τα μετάγραφα 4 και 14 πέρα από δύο ευρήματα σχεδόν στατιστικώς σημαντικά, δεν υπήρξε κάποια άλλη αξιόλογη παρατήρηση. Στο γενικότερο πλαίσιο της μελέτης τα περισσότερα αποτελέσματα δεν είναι στατιστικώς σημαντικά, λόγω του μικρού αριθμού δειγμάτων που αναλύθηκαν. Μετά τη προσπάθεια αύξησης του cohort των ασθενών που μελετήθηκαν, λήθφησαν κάποιες αξιόλογες παρατηρήσεις και μάλιστα με στατιστική σημαντικότητα ενώ κάποιες άλλες έδειξαν προς τα που θα πρέπει να κινηθεί η έρευνα. Το μόνο σίγουρο είναι ότι απαιτείται μεγαλύτερος αριθμός δειγμάτων για την άντληση ασφαλέστερων και πιο αξιόπιστων αποτελεσμάτων.
