Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Παντερή Ειρήνη, Καθηγήτρια, τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
Βαρβαρέσου Αθανασία, Καθηγήτρια, Τμήμα Βιοϊατρικών Επιστημών, ΠΑΔΑ
Θωμαΐδης Νικόλαος, Καθηγητής, τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ
Οικονόμου Αναστάσιος, Καθηγητής, τμήμα Χημείας ΕΚΠΑ
Λουκάς Ιωάννης, Αναπληρωτής Καθηγητής, τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
Γκίκας Ευάγγελος, Επίκουρος Καθηγητής, τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
Ντότσικας Ιωάννης, Επίκουρος Καθηγητής, τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Η γήρανση του δέρματος, τόσο από βιολογικά, όσο και από περιβαλλοντικά αίτια, είναι μία διαδικασία που απασχολεί πολύ τον σύγχρονο άνθρωπο. Οι επιστήμες της Βιολογίας, Φαρμακευτικής, Κοσμητολογίας και Ιατρικής, αφιερώνουν μεγάλο μέρος από το ερευνητικό τους έργο στην εύρεση λύσεων στα προβλήματα που προκαλούνται στο δέρμα από την γήρανση, στη δομή και στην λειτουργία του. Παρόλο που οι περισσότερες έρευνες, αφορούν το χόριο, πρόσφατες μελέτες εστιάζουν το ενδιαφέρον τους, στην γήρανση της επιδερμίδας και τους πιθανούς τρόπους αντιμετώπισής της. Αυτό οφείλεται στην επίπτωση που έχει η γήρανση της επιδερμίδας στην εμφάνιση και στην ψυχολογία των ατόμων.
Η χρήση των βιοενεργών πεπτιδίων, αποτελεί ευρεία και δυναμική λύση στον χώρο της Κοσμητολογίας για την αντιμετώπιση της γήρανσης του δέρματος.
Τα κοσμητολογικά προϊόντα που μεταφέρουν μία βιολογική δράση για την ενίσχυση της καλλυντικής τους δράσης, ονομάζονται cosmeceuticals.
Στην παρούσα διατριβή, μελετήσαμε δύο βιοενεργά πεπτίδια:
-Το ακετυλο εξαπεπτίδιο-3 (Argireline®), είναι ένα συνθετικό πεπτίδιο, το οποίο υπάρχει στο εμπόριο, ως συστατικό για προϊόντα περιποίησης κυρίως των ματιών και έχει σχεδιαστεί σύμφωνα με το πρότυπο του Ν- τελικού άκρου της πρωτεΐνης SNAP-25.
-Το τριπεπτίδιο-10 κιτρουλλίνη, (Decorinyl®) είναι ένα συνθετικό πεπτίδιο , το οποίο μιμείται τις αλληλουχίες της decorin, που συνδέονται με τα ινίδια κολλαγόνου.
Αντικείμενο της μελέτης, ήταν η αντιγηραντική δράση των δύο αυτών πεπτιδίων, καθώς και η πιθανότητα συνεργιστικής τους δράσης.
Οποιοδήποτε κοσμητολογικό προϊόν εμπεριέχει βιοενεργά πεπτίδια θα πρέπει να υποβληθεί σε έλεγχο αποτελεσματικότητας και ασφάλειας προκειμένου να επιτραπεί η εμπορευματοποίησή του.
Η συγκέντρωση του πεπτιδίου στα κοσμητολογικά προϊόντα, πρέπει να υποστηρίζεται από κλινικές μελέτες. Η συμβατότητα και η σταθερότητα ενός βιοενεργού πεπτιδίου, μέσα σε ένα καλλυντικό σκεύασμα, είναι ένδειξη ότι μπορεί να φτάσει στο δέρμα σε ενεργό μορφή.
Η αναλυτική διαδικασία, τόσο για τα φάρμακα, όσο και για τα βιοτεχνολογικής προέλευσης προϊόντα, όπως τα βιοενεργά πεπτίδια είναι απαραίτητη. Η επικύρωση μιας αναλυτικής διαδικασίας εξασφαλίζει ότι οι στόχοι της πληρούνται και είναι αξιόπιστοι, άρα και οι καταναλωτές είναι ασφαλείς.
Η διατριβή διακρίνεται σε θεωρητικό και πειραματικό μέρος.
Στο πρώτο κεφάλαιο του θεωρητικού μέρους (κεφάλαιο 1ο), δίνονται στοιχεία για την δομή των πεπτιδίων, τον σχηματισμό πεπτιδικών δεσμών και την λειτουργικότητά τους. Τα βιοενεργά πεπτίδια, είναι πεπτίδια που συντίθενται στο εργαστήριο, αλλά αποτελούνται από τροποποιημένες αλυσίδες αμινοξέων, οι οποίες βελτιώνουν μία ήδη υπάρχουσα φυσιολογική λειτουργία, όπως την αύξηση της διαπερατότητας του δέρματος, τη σταθερότητα, τη διαλυτότητα, κ.ά. Οι εφαρμογές των βιοενεργών πεπτιδίων είναι πολλές. Δρουν ως σηματοδότες, μεταφορείς, αναστολείς των νευροδιαβιβαστών κ.ά. Επίσης περιγράφονται τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των δύο πεπτιδίων του ενδιαφέροντός μας, του ακετυλο εξαπεπτιδίου -3 και του τριπεπτιδίου -10 κιτρουλλίνης και γίνεται επισκόπηση των πειραματικών αναφορών τους μέχρι τώρα.
Στο δεύτερο κεφάλαιο του θεωρητικού μέρους (κεφάλαιο 2ο), περιγράφεται η σύσταση του φυσιολογικού ανθρώπινου δέρματος και η ανατομία του. Επίσης περιγράφονται οι αλλαγές που παρατηρούνται κατά την γήρανση. Η λέπτυνση του δέρματος, οι ρυτίδες, οι δυσχρωμίες και η ελάστωση είναι χαρακτηριστικά του γηρασμένου δέρματος. Η ποιότητα αλλά και η ποσότητα των ινών του δέρματος, (ελαστίνης και κολλαγόνου) αλλά και η περιεκτικότητά του σε υγρασία, παίζουν καθοριστικό ρόλο στην εμφάνιση της γήρανσης.
Στο τρίτο κεφάλαιο του θεωρητικού μέρους (κεφάλαιο 3ο), περιγράφεται η έννοια της χρωματογραφικής ανάλυσης με την μέθοδο της υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης (HPLC) και ιδιαίτερα της υγροχρωματογραφίας υδρόφιλης αλληλεπίδρασης (HILIC). Γίνεται εκτενής αναφορά στις μέχρι τώρα βιβλιογραφικές αναφορές και μελέτες όσον αφορά την χρωματογραφική ανάλυση πεπτιδίων με υγροχρωματογραφία υδρόφιλης αλληλεπίδρασης.
Ακολουθεί το πειραματικό μέρος της εργασίας, το οποίο χωρίζεται σε τρείς ενότητες.
Στο πρώτο πειραματικό μέρος (κεφάλαιο 4) έγινε αναφορά στις διάφορες στήλες υγροχρωματογραφίας υδρόφιλης αλληλεπίδρασης και στο υλικό τους. Για τη χρωματογραφική ανάλυση του ακετυλο εξαπεπτιδίου-3 λαμβάνονται υπόψη τα φυσικοχημικά του χαρακτηριστικά του. Η στατική φάση και η κινητή φάση επιλέγονται μετά από μελέτη της επίδρασης του άλατος, της περιεκτικότητας σε νερό και του ρΗ στη χρωματογραφική συμπεριφορά του πεπτιδίου.
Στο δεύτερο πειραματικό μέρος της διατριβής (κεφάλαιο 5ο), έγινε ανάπτυξη και επικύρωση αναλυτικής μεθόδου, για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ακετυλο εξαπεπτιδίου–3 σε καλλυντικό προϊόν. Στην αναλυτική διαδικασία που ακολουθήσαμε χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη μεθόδου, ισοκρατικές συνθήκες έκλουσης, σε σύστημα υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης συνδεδεμένο με ανιχνευτή υπεριώδους ακτινοβολίας (LC-UV). Η επικύρωση της μεθόδου, έγινε σε σύστημα υγροχρωματογραφίας υψηλής απόδοσης συνδεδεμένο με ανιχνευτή συστοιχίας φωτοδιόδων, (Photodiode Array Detector PDA). Η αναλυτική στήλη που χρησιμοποιήθηκε είναι η BEH XBridge HILIC 2,1x150mm και μέγεθος σωματιδίων 3,5μm. Η κινητή φάση που χρησιμοποιήθηκε είναι η Ακετονιτρίλιο /ρυθμιστικό διάλυμα μυρμηκικού αμμωνίου συγκέντρωσης 20 mM, σε αναλογία 70/30 v/v. Ως βέλτιστο pH του ρυθμιστικού διαλύματος, επιλέχθηκε το pH 7,5 ενώ η ταχύτητα ροής ρυθμίστηκε στα 0,25 mL/min. Η ανίχνευση έγινε στα 214 nm. Η έκλουση του πεπτιδίου έγινε περίπου στα 8 λεπτά. Κατά την επικύρωση της μεθόδου, έγινε μελέτη για την κατεργασία της κρέμας και καθορισμός των βέλτιστων χρωματογραφικών συνθηκών. Τέλος στην αξιολόγηση, ελέγχθηκαν τα κύρια χαρακτηριστικά ποιότητας, δηλαδή, η γραμμικότητα, η ορθότητα, η πιστότητα, η ανθεκτικότητα και η ειδικότητα της μεθόδου.
Στο τρίτο πειραματικό μέρος της διατριβής (κεφάλαιο 6ο), αντικείμενο της μελέτης ήταν η παρατήρηση του δέρματος με απεικονιστικές μεθόδους, μετά από την εφαρμογή κοσμητολογικού προϊόντος που περιείχε, ή όχι, ένα από τα δύο, ή και τα δύο αυτά πεπτίδια και η καταγραφή της επίδρασής τους στην βελτίωση του ανάγλυφου της επιδερμίδας και της υγρασίας της, μεμονωμένα, ή συνεργιστικά. Το μικροανάγλυφο του δέρματος, είναι ανισότροπο και οι αλλαγές του αυξάνουν με την ηλικία. Για την τρισδιάστατη απεικόνιση δέρματος, χρησιμοποιήθηκε η άμεση μέθοδος απεικόνισης της επιφάνειας του δέρματος με UVA κάμερα (Skin Visioscan VC98). Οι παράμετροι που επιλέξαμε να μελετήσουμε, είναι το R2 (μέγιστη τραχύτητα) και το R3 (μέση τραχύτητα). Και στις δύο παραμέτρους τραχύτητας επιλέγουμε τη μέτρηση των κυκλικών ρυτίδων (cR2, cR3).
Η διαδερμική απώλεια ύδατος, (Transepidermal Water Loss TEWL), μετρήθηκε με το TEWAMETER.
Τέλος, στο τέταρτο πειραματικό μέρος (κεφάλαιο 7ο), έγινε ιστολογική παρατήρηση του δέρματος μετά από εφαρμογή των ίδιων κοσμητολογικών προϊόντων. Ελήφθησαν δείγματα βιοψιών, στα οποία έγινε μονιμοποίηση και παρατήρηση στο οπτικό μικροσκόπιο, μετά από χρώση τους με αιματοξυλίνη- ηωσίνη και τρίχρωμη χρώση Masson. Ο στόχος ήταν να παρατηρηθεί η πιθανή αύξηση του πάχους της επιδερμίδας, ή και του χορίου, καθώς και η μορφολογική παρατήρηση της δομής του χορίου, ως προς τις ίνες κολλαγόνου και ελαστίνης. Η ένταση του χρώματος, η οποία προκύπτει από την ποσότητα του κολλαγόνου στο δέρμα, αλλά και το πάχος της επιδερμίδας και του χορίου, είναι οι παράγοντες που μας δηλώνουν αύξηση της ποσότητας του κολλαγόνου και άρα βελτίωση της δομής του δέρματος.
