Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Κρούπης Χρήστος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Περίληψη:
Εισαγωγή: Το ψευδοαποφολιδωτικό σύνδρομο (pseudoexfoliation syndrome, PEX) είναι μία σχετιζόμενη με την ηλικία διαταραχή της εξωκυττάριας μήτρας, η οποία χαρακτηρίζεται από την παραγωγή και την προοδευτική συσσώρευση ενός ινώδους υλικού σε διάφορους ενδοφθάλμιους και εξωφθάλμιους ιστούς. Το PEX συνδέεται στενά με την ανάπτυξη ψευδοαποφολιδωτικού γλαυκώματος (pseudoexfoliation glaucoma, PEXG). Το PEXG θεωρείται ο πιο κοινός τύπος δευτεροπαθούς γλαυκώματος ανοιχτής γωνίας και χαρακτηρίζεται από υψηλότερη ενδοφθάλμια πίεση και χειρότερη πρόγνωση από το πρωτογενές γλαύκωμα ανοιχτής γωνίας (Primary Open-Angle Glaucoma, POAG). Το PEX είναι κοινό στην Ελλάδα (11,9% σε άτομα >60 χρονών). Σε προηγούμενη έρευνα μας (αλλά και σε πολλές παγκόσμιες μελέτες) μελετήθηκαν δύο σημειακοί νουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNPs) του LOXL1 γονιδίου οξειδάσης της λυσίνης-1 (G153D και R141L) και βρέθηκε ότι συνδέονται ισχυρά τόσο με το PEX, όσο και με το PEXG. Ωστόσο, η συχνότητα των ανωτέρω πολυμορφισμών βρέθηκε υψηλή και στα άτομα των ομάδων ελέγχου, ενώ περαιτέρω λειτουργικές μελέτες και προγράμματα βιοπληροφορικής αδυνατούν να εξηγήσουν τη συσχέτιση τους με το νόσημα.
Σκοπός: Η ανάπτυξη και επικύρωση καινοτόμου και αξιόπιστης ανίχνευσης ενός νέου ιντρονικού LOXL1 πολυμορφισμού (rs11638944, C>G) -που με βάση τη πιο πρόσφατη διεθνή μελέτη επηρεάζει τα επίπεδα LOXL1 mRNA στους οφθαλμικούς ιστούς- καθώς και η αξιολόγηση του σε PEX/PEXG Ελληνικό πληθυσμό.
Υλικό-Μέθοδοι: Αναλύθηκαν 242 DNA δείγματα (49 PEX, 64 PEXG, 79 δείγματα υγιών μαρτύρων και 50 POAG ως clinical relevant controls) από Ελληνες της Ηπείρου, ίδιας κατανομής ηλικίας. Για τη LOXL1 γονοτύπηση του ιντρονικού πολυμορφισμού αναπτύχθηκαν και βελτιστοποιήθηκαν καινοτόμες μεθοδολογίες: α) real-Time qPCR με ανάλυση καμπυλών τήξεως στην πλατφόρμα LightCycler για ταχεία, αξιόπιστη και οικονομική γονοτύπηση σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων καθώς και β) συμβατική PCR-RFLP μέθοδος για μικρό αριθμό δειγμάτων. Σε επιλεγμένα δείγματα η ορθότητα ελέγχθηκε με τη μέθοδο αναφοράς DNA Sequencing. Για τη στατιστική αξιολόγηση της συσχέτισης του πολυμορφισμού χρησιμοποιήθηκαν τα λογισμικά προγράμματα SNPStats και το SPSS.
Αποτελέσματα-Συμπεράσματα: Η μεθοδολογία qPCR ήταν αξιόπιστη, επιδεικνύοντας καλή απόδοση, πιστότητα (C αλλήλιο: το CV του Cq είναι 4,2% και G αλλήλιο: το CV του Cq είναι 0,9%), ορθότητα στη γονοτύπηση (με βάση τη μέθοδο DNA Sequencing και 100% συμφωνία με τη μέθοδο PCR-RFLP) και καλό διαχωρισμό αλληλίων στην καμπύλη τήξεως (C:Tm=53,26oC, G:Tm=61,83oC, ΔTm=8,57oC).
Τα αποτελέσματα στους ασθενείς έδειξαν ισορροπία κατά Hardy-Weinberg σε όλες τις ομάδες δειγμάτων (p>0,05). Για το PEX: αύξηση συχνότητας ομοζυγωτών G/G από 18% στους υγιείς μάρτυρες σε 61% στους ασθενείς, συνεπώς το C αλλήλιο είναι προστατευτικό για το PEX (OR=0,22 (0,11-0,42), p<0,0001). Για το PEXG: αύξηση συχνότητας ομοζυγωτών G/G από 18% στους υγιείς σε 70% στους ασθενείς, με το C αλλήλιο να είναι προστατευτικό για το PEXG (OR = 0,13 (0,06-0,25), p<0,0001).
Στους δύο προηγούμενους πολυμορφισμούς που μελετήθηκαν στο εργαστήριο το G αλλήλιο είναι επίσης το αλλήλιο κινδύνου και σύμφωνα με τον έλεγχο απλοτύπου που πραγματοποιήθηκε, δύο είναι οι απλότυποι που βρέθηκε να δρουν προστατευτικά: ο CGT (OR=0,46) και ο CAG (OR=0,04).
Συνεπώς, από τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκε η σύνδεση του συγκεκριμένου ιντρονικού πολυμορφισμού του LOXL1 γονιδίου με το PEX και το PEXG στο συγκεκριμένο Ελληνικό πληθυσμό.
Λέξεις-κλειδιά:
PEX, PEXG, LOXL1, SNP, PCR-RFLP, Real Time qPCR, Melting curve analysis
