Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ισιδώρα Σ. Παπασιδέρη
Καθηγήτρια, Τομέας Βιολογίας Κυττάρου και Βιοφυσικής,
Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Δημήτριος Ι. Στραβοπόδης
Αναπληρωτής καθηγητής, Τομέας Βιολογίας Κυττάρου & Ανάπτυξης,
Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Ευθύμιος Σκουλάκης
Αναπληρωτής Διευθυντής, Ερευνητής Α’, Τομέας Νευροεπιστημών
Ινστιτούτο Βασικής Βιοϊατρικής Έρευνας Ε.ΚΕ.ΒΕ «ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΦΛΕΜΙΓΚ»
Περίληψη:
Η εκθετική αύξηση του προσδόκιμου ζωής τα τελευταία χρόνια έχει φέρει στο προσκήνιο ασθένειες που σχετίζονται άμεσα με τη γήρανση του οργανισμού. Μεταξύ άλλων, οι Tau-πάθειες, όπως η νόσος Alzheimer και η μετωποκροταφική άνοια, που επηρεάζουν άτομα ηλικίας 65 ετών και άνω, επιφέρουν αργά και βαθμιαία διαταραχές στη μνήμη, στην κρίση, στην ικανότητα κατανόησης και έκφρασης του λόγου, έκπτωση στην καθημερινή λειτουργικότητα και χωροχρονικό αποπροσανατολισμό. Οι Tau-πάθειες ως νοσολογικές οντότητες χαρακτηρίζονται ιστοπαθολογικά από την ενδονευρωνική συσσώρευση της υπερφωσφορυλιωμένης πρωτεΐνης Tau, η οποία αλλάζει διαμόρφωση στο χώρο και δημιουργεί συσσωματώματα. Αυτό δεν είναι σε καμία περίπτωση αναμενόμενο για μία πρωτεΐνη τόσο υδατοδιαλυτή όσο η Tau, της οποίας η αλληλουχία είναι εγγενώς μη δομημένη, ανθεκτική στις μεταβολές της θερμοκρασίας και της τιμής του pH, και πλούσια σε πολικά αμινοξέα. Παρόλα αυτά, κάτω από αδιευκρίνιστες μέχρι στιγμής συνθήκες, η Tau χάνει τη διαμόρφωση τύπου «συνδετήρα», που ευνοεί την πρόσδεση της αλληλουχίας της στους μικροσωληνίσκους. Αντ’ αυτού, δημιουργεί β-πτυχωτές επιφάνειες, οι οποίες διαπλέκονται μεταξύ τους για να σχηματίσουν ολιγομερή και στο καταληκτικό στάδιο της Tau-πάθειας ώριμα συσσωματώματα.
Η ερευνητική ομάδα της Δρ. Κατερίνας Παπανικολοπούλου στο Ερευνητικό Κέντρο Βιοϊατρικών Επιστημών «Αλέξανδρος Φλέμιγκ» επιχείρησε να αποσαφηνίσει τον in vivo μηχανισμό συσσωμάτωσης της Tau. Στο πλαίσιο αυτής της προσπάθειας, αναζητήθηκαν πρωτεΐνες, που αλληλεπιδρούν με την ανθρώπινη, αγρίου τύπου Tau στο κεντρικό νευρικό σύστημα της Drosophila melanogaster και που πιθανόν εμπλέκονται σε ειδικά ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια. Μια σειρά πρωτεομικών πειραμάτων οδήγησε στην απροσδόκητη ταυτοποίηση της Δροσοφιλικής MICAL (Mical) ως κυτταρικού παρτενέρ της Tau. Η πρωτεΐνη Mical αποτελεί μία φλαβινική μονοοξυγενάση με πολλές δομικές επικράτειες, που οξειδώνει επιφανειακά κατάλοιπα κυστεΐνης ή μεθειονίνης σε κατάλληλα υποστρώματα. Με αυτόν τον τρόπο ελέγχει τη δράση τους, ενώ παράλληλα εμπλέκεται σε αναπτυξιακά φαινόμενα του εγκεφάλου, όπως το δενδριτικό κλάδεμα και τη νευραξονική καθοδήγηση, ή σε παθολογικές καταστάσεις, που σχετίζονται με ακτινο-εξαρτώμενες διεργασίες. Μέσα από τον έλεγχο έκδυσης διαγονιδιακών μυγών, που εξέφραζαν παν-νευρωνικά Tau και ένα διαγονίδιο της δροσοφιλικής Mical ή του Mical-RNAi, διαπιστώθηκε ότι η αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών είναι τοξική, δεδομένου ότι η υπερέκφραση της Mical οδηγούσε σε μείωση των ενήλικων μυγών που εξέρχονταν από τη νυμφική κάψα, ενώ η μειορρύθμισή της οδηγούσε σε αύξηση των ενήλικων απογόνων. Παράλληλα, βρέθηκε ότι η MICAL-1 του ανθρώπου (ορθόλογη της δροσοφιλικής Mical) υπερεκφράζεται στον εγκέφαλο ασθενών με Alzheimer και νόσο του Pick, όμως, συνεντοπίζεται μόνο με τις 3R ισομορφές της Tau στα σωμάτια του Pick και όχι με το μείγμα 3R και 4R ισομορφών στα νευροϊνιδιακά δεμάτια.
Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η γενετική αλληλεπίδραση Mical-Tau στο κεντρικό νευρικό σύστημα της Drosophila melanogaster για να διαπιστωθεί: 1) αν η Mical επηρεάζει διαφορετικά τις 3R και τις 4R ισομορφές, 2) αν διαταράσσει τη φυσιολογική λειτουργία της Tau ως κυτταροσκελετικής πρωτεΐνης και 3) αν επάγει την εξαρτώμενη από την Tau νευρωνική τοξικότητα. Για αυτό το σκοπό, δημιουργήθηκαν έξι σειρές διαγονιδιακών μυγών, οι οποίες εξέφραζαν παν-νευρωνικά ένα διαγονίδιο της Tau (0Ν3R, 0Ν4R, 1Ν3R, 1Ν4R, 2Ν3R, 2Ν4R) με τη βοήθεια του γενετικού συστήματος GAL4/UAS, ενώ παράλληλα αυξομειώνονταν τα επίπεδα της Mical (στελέχη ελέγχου, υπερέκφρασης και μειορρύθμισης της Mical). Τα στελέχη αυτά χρησιμοποιήθηκαν σε απλά πειράματα western blot ή παραλλαγές αυτών, όπως είναι το πρωτόκολλο απομόνωσης συσσωματωμάτων και πρόσδεσης στους μικροσωληνίσκους. Σημειώνεται, ότι μόνο στο πρώτο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν και οι έξι ισομορφές - σε όλα τα υπόλοιπα αξιοποιήθηκαν μόνο οι (2N) ισομορφές της Tau. Για τον έλεγχο της τοξικότητας της Tau συναρτήσει των επιπέδων της Mical, πραγματοποιήθηκαν πειράματα μακροζωίας, αντίστασης στο οξειδωτικό στρες και παρατήρησης του rough eye φαινότυπου, ενώ αποκλειστικά και μόνο για την 2N4R ισομορφή προσδιορίστηκε το δίκτυο αλληλεπιδράσεων της Tau, όταν η Mical μειορρυθμίζεται με ένα Mical-RNAi. Τα πειράματα μακροζωίας και μελέτης του δικτύου αλληλεπιδράσεων βασίστηκαν σε στελέχη της Drosophila, όπου ο έλεγχος της διαγονιδιακής έκφρασης γινόταν από το σύστημα TARGET.
Επιγραμματικά, τα αποτελέσματα που προέκυψαν είναι τα εξής:
• Η αυξομείωση των επιπέδων έκφρασης της Mical στο κεντρικό νευρικό σύστημα της Drosophila μεταβάλλει αναλογικά τα επίπεδα των 3R και των 4R ισομορφών της Tau
• Η Mical ενισχύει την τάση των 2N3R και 2Ν4R ισομορφών προς συσσωμάτωση στους νευρώνες
• Η σύνδεση των 2N ισομορφών στο in vivo δίκτυο των μικροσωληνίσκων της μύγας δεν επηρεάζεται από τη μεταβολή των επιπέδων της Mical στον εγκέφαλο
• Η αλληλεπίδραση Mical-Tau επιδεινώνει τον rough eye φαινότυπο της 2N4R ισομορφής
• Οι μη στατιστικά σημαντικές διαφορές στις καμπύλες βιωσιμότητας των διαγονιδιακών στελεχών οφείλονται σε συστηματικό σφάλμα (αδυναμία διατήρησης σταθερής θερμοκρασίας στον επωαστήρα) και όχι στην πραγματική επίδραση της Mical επί της τοξικότητας των 2N3R και 2N4R ισομορφών.
• Η αντίσταση των μυγών στο οξειδωτικό στρες μειώνεται όταν η 2N3R ή η 2N4R συνεκφράζεται με τη Mical στο κεντρικό νευρικό τους σύστημα.
• Το δίκτυο αλληλεπιδράσεων της 2N4R ισομορφής μεταβάλλεται όταν μειορρυθμίζεται η Mical.
