Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Επιβλέπων: κ. Ανδρέας Σκορίλας, Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστεως αποτελεί τη δεύτερη πιο συχνή νεοπλασία του ουροποιητικού συστήματος στο αντρικό φύλο ενώ πλήττει το γυναικείο φύλο τρεις έως τέσσερις φορές λιγότερο. Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του συγκεκριμένου καρκίνου είναι ότι παρουσιάζει τον υψηλότερο ρυθμό υποτροπής συγκριτικά με όλους τους άλλους τύπους. Η ιδιαιτερότητά του αυτή το καθιστά ένα εξαιρετικά σημαντικό ζήτημα υγείας και σε συνδυασμό με το μεγάλο κόστος των διαγνωστικών και θεραπευτικών προσεγγίσεων, όπως οι συχνές κυστεοσκοπήσεις και διουρηθρικές εκτομές των όγκων, είναι εμφανές ότι αποτελεί έναν από τους πιο κοστοβόρους για τα συστήματα υγείας καρκίνους. Επομένως, διαφαίνεται η ανάγκη εύρεσης βιοδεικτών που θα επιτρέπουν τη διάγνωση, την πρόγνωση και την παρακολούθηση των ασθενών, χωρίς να απαιτούνται οι επεμβατικές προσεγγίσεις που έως σήμερα αποτελούν πρότυπες διαδικασίες. Τα μη κωδικά μόρια RNA (ncRNAs) μπορούν πιθανά να λειτουργήσουν ως βιοδείκτες με σημαντική συνεισφορά στη βιοϊατρική κοινότητα, διότι διαθέτουν σημαντικά πλεονεκτήματα, όπως η δυνατότητα σχετικά εύκολης, αξιόπιστης και ταχείας ποσοτικοποίησης. Η παρούσα διπλωματική εργασία εστιάζει στη μελέτη ενός αναδυόμενου και καινοτόμου υποσυνόλου των μη κωδικών μορίων, τα θραύσματα που προκύπτουν από τα tRNA μόρια (tRFs/t-halves (thalves ή tiRNAs)) και στη συσχέτιση τους με το οξειδωτικό φορτίο των καρκινικών ιστών που έχουν αφαιρεθεί από ασθενείς με συγκεκριμένα κλινικοπαθολογικά ευρήματα. Για να επιτευχθεί αυτή η διασύνδεση ακολουθήθηκε συγκεκριμένος θεωρητικός και πειραματικός σχεδιασμός. Συγκεκριμένα, μέσω βιοπληροφορικής ανάλυσης αξιοποιήθηκαν δεδομένα από πειράματα αλληλούχησης νέας γενιάς (NGS) και επιλέχθηκαν τα θραύσματα προς μελέτη. Για την ποσοτικοποίηση αυτών των θραυσμάτων στα δείγματα ασθενών πραγματοποιήθηκε ο in silico σχεδιασμός εκκινητών, η ομογενοποίηση των ιστοτεμαχίων που πάρθηκαν από τους ασθενείς, η εφαρμογή και βελτιστοποίηση των πρωτοκόλλων πολυαδενυλίωσης και αντίστροφης μεταγραφής και η εφαρμογή της μοριακής μεθοδολογίας, ποσοτική PCR (qPCR). Η συσχέτισή των μη κωδικών RNA που ανιχνεύτηκαν, με το οξειδωτικό στρες πραγματοποιήθηκε μέσω και της μελέτης των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων GSTP1, MnSOD2, NRF2, η οποία κατέστη εφικτή λόγω του σχεδιασμού κατάλληλων εκκινητών που επέτρεψαν την ενίσχυση των περισσότερων μεταγραφικών προϊόντων που παράγονται από τα συγκεκριμένα γονίδια και της βιοστατιστικής ανάλυσης συσχέτισης κατά Spearman. Επιπλέον, στο πλαίσιο της διπλωματικής, οι κυτταρικές σειρές που προσομοιάζουν διάφορα στάδια του καρκίνου της κύστεως (RT112, T24) και τα δείγματα ασθενών βρέθηκαν να εκφράζουν 10 διαφορετικούς τύπους θραυσμάτων που προέρχονται από tRNA μόρια τα οποία κωδικοποιούνται τόσο από το μιτοχονδριακό γονιδίωμα όσο και από το πυρηνικό. Τα θραύσματα που ανιχνεύτηκαν είναι τα εξής: ts-36, 3 ́-half-His-GTG, 5 ́-half-Val-TAC, 5 ́-half-Met-CAT, 3 ́-tRF-Val-TAC, 5 ́-half-Val-AAC, i-Gln-CTG, i-Val-TAC, 5 ́-tRF-Gly-CCC και ts-46.
Από το σύνολο των θραυσμάτων που ανιχνεύτηκαν επιλέχθηκαν να μελετηθούν στην κοόρτη των ασθενών (n=120 δείγματα απομονωμένου ολικού RNA) τα επίπεδα έκφρασης των 3 ́-half-His-GTG, 5 ́-half-Val-TAC και 5 ́-half-Met-CAT, καθώς αποτελούν μη κωδικά μόρια που κωδικοποιούνται αποκλειστικά από το μιτοχονδριακό γονιδίωμα και ανήκουν στην κατηγορία των t-halves (thalves ή tiRNAs). Η βιβλιογραφική μελέτη έθεσε τις βάσεις της διπλωματικής αυτής εργασίας διότι επέτρεψε τη διατύπωση της εξής ερευνητικής υπόθεσης: Τα μη κωδικά μόρια, tRFs/t-halves (thalves ή tiRNAs), παράγονται εντονότερα υπό στρεσογόνες συνθήκες που χαρακτηρίζουν τους καρκινικούς ιστούς και καθοριστικό ρόλο στη διαμόρφωση και την ενίσχυση του οξειδωτικού φορτίου διαδραματίζει η λειτουργία των μιτοχονδρίων.
Συμπερασματικά, τα επίπεδα της έκφρασης και των τριών μη κωδικών μορίων αυξάνονται καθώς αυξάνεται ο βαθμός αποδιαφοροποίησης του όγκου (3 ́half-His-GTG, p=0.006) και σε πιο προχωρημένα στάδια της νόσου, με τους μυοδιηθητικούς όγκους (Τ2-Τ4) να παρουσιάζουν τις υψηλότερες τιμές. Η ανάλυση επιβίωσης υποδηλώνει ότι η αυξημένη έκφρασή τους σχετίζεται με δυσμενή πρόγνωση των ασθενών που υπέστησαν είτε διουρηθρική αφαίρεση του όγκου που είχε αναπτυχθεί στην ουροδόχο κύστη (μη μυοδιηθητικοί όγκοι) είτε ριζική κυστεκτομή (μυοδιηθητικοί όγκοι). Τέλος, η μείωση των επιπέδων του 5 ́half-Val-TAC και του 5’half-Met-CAT σε συνθήκες αυξημένης έκφρασης του γονιδίου GSTP1 και μειωμένης έκφρασης του γονιδίου MnSOD2 υποδηλώνει πιθανώς ότι οι στρεσογόνες κυτταρικές συνθήκες σχετίζονται με την παραγωγή των t-halves (tiRNAs) που προκύπτουν από μιτοχονδριακά κωδικοποιούμενα tRNA μόρια .
Για την κατανόηση του βιολογικού ρόλου των θραυσμάτων και των γονιδίων που μελετήθηκαν χρησιμοποιήθηκαν βιοπληροφορικά εργαλεία και δεδομένα. Για τα θραύσματα εντοπίστηκαν, μέσω αλγορίθμων πρόγνωσης, οι πιθανοί στόχοι, κάνοντας την παραδοχή ότι δρουν με τρόπο όμοιο με τα miRNAs, όπως έχει αναφερθεί βιβλιογραφικά και σχεδιάστηκαν τα αντίστοιχα ενδοκυτταρικά τους δίκτυα, στη λογική της βιολογίας συστημάτων (Gene ontology analysis/ KEGG network analysis). Τα πειράματα μελέτης των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων GSTP1 και MnSOD2 που πραγματοποιήθηκαν στα δείγματα των ασθενών με καρκίνο της κύστεως (πειραματικά qPCR δεδομένα) επιβεβαιώθηκαν και από τα δεδομένα της βάσης The Human Protein Atlas τόσο σε επίπεδο mRNA όσο και σε επίπεδο πρωτεϊνών, καθώς τα πειράματα ανοσοϊστοχημείας ανέδειξαν τον εντοπισμό των πρωτεϊνών αυτών σε ουροθηλιακά καρκινώματα.
Η παρούσα εργασία βασίστηκε στον συγκερασμό βιοπληροφορικών, βιοστατιστικών και πειραματικών διαδικασιών για τη διεξαγωγή των παραπάνω συμπερασμάτων και ενίσχυσε ακόμη περισσότερο τη θεώρηση ότι το οξειδωτικό στρες που υφίστανται τα καρκινικά κύτταρα συνδέεται πιθανώς με την κινητοποίηση της παραγωγής διαφόρων μη κωδικών μορίων, όπως τα t-halves (thalves ή tiRNAs).
Λέξεις-κλειδιά:
θραύσματα που προέρχονται από tRNA μόρια, μη κωδικά μόρια RNA, οξειδωτικό στρες, καρκίνος ουροδόχου κύστεως
