Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Αλέξιος Λέανδρος Σκαλτσούνης, Καθηγητής, Φαρμακευτική, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών.
Σοφία Μητάκου, Καθηγήτρια, Φαρμακευτική, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών.
Νεκτάριος Αλιγιάννης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Φαρμακευτική, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών.
Μαρία Χαλαμπαλάκη, Επίκουρη Καθηγήτρια, Φαρμακευτική, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών.
Jean-Hugues Renault, Professor, Plant Science Department, Université de Reims Champagne Ardenne-Institute of Molecular Chemistry of Reims.
Hermann Stuppner, Professor, Institute of Pharmacy, University of Innsbruck.
Wirginia Kukula-Koch, Associate Professor, Department of Pharmacognosy with Medicinal Plant Unit, Medical University of Lublin.
Περίληψη:
Τα φυτικά έλαια θεωρούνται αναπόσπαστο τμήμα της ανθρώπινης διατροφής και πολλά αρχαία χειρόγραφα αναφέρονται στις πολλαπλές καθημερινές χρήσεις τους, ως τρόφιμα και καλλυντικά. Τα φυτικά έλαια ,αντιπροσωπεύουν την κύρια δεξαμενή λιπαρών οξέων της διατροφής του ανθρώπου και σχετίζονται με την γεύση των τροφίμων λόγω του αρώματος και των ειδικών οργανοληπτικών ιδιοτήτων τους. Σύμφωνα με μελέτες, η μέση κατανάλωση λιπαρών φτάνει τα 25 kg ανά άτομο ετησίως, με το 80% να καλύπτεται από τα φυτικά έλαια. Επιπλέον, συμβάλλουν σημαντικά στην ευημερία του ανθρώπου και στη βελτίωση της ποιότητας ζωής, λόγω των δερμο-καλλυντικών ιδιοτήτων τους. Παράλληλα, οι ανάγκες της αγοράς για φυσικά και βρώσιμα προϊόντα στον φαρμακευτικό και δερμο-καλλυντικό τομέα αυξάνονται κάθε χρόνο. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα παραπάνω, είναι σαφώς προφανείς οι λόγοι για τους οποίους τα φυτικά έλαια βρίσκονται υπό επιστημονική μελέτη. Η χημική σύνθεση τους χαρακτηρίζεται κυρίως από γλυκερίδια, κορεσμένα λιπαρά οξέα, μονοακόρεστα λιπαρά οξέα και πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Η πληθώρα ευεργετικών για την υγεία επιδράσεων που παρέχονται από τα διάφορα λιπαρά οξέα των ελαίων αυτών, είναι γνωστές. Οι σημαντικότερη ιδιότητα των μονοακόρεστων λιπαρών οξέων είναι η πρόληψη των καρδιαγγειακών παθήσεων μέσω διαφορετικών μηχανισμών. Παράλληλα, τα φυτικά έλαια είναι πηγή πολλών πολυακόρεστων λιπαρών οξέων όπως το λινολεϊκό, το οποίο μεταξύ άλλων θεωρείται σημαντικός αντι-αθηρογόνος και αντι-θρομβωτικός παράγοντας και δεν μπορεί να συντεθεί από τον ανθρώπινο οργανισμό. Επιπλέον, η μεγάλη πλειοψηφία των φυτικών ελαίων περιέχει μια κατήγορία ουσιών με ιδιαίτερα σημαντικές βιολογικές δράσεις, που ονομάζονται βιο-φαινόλες. Αυτές οι ενώσεις αντιπροσωπεύουν ένα πολύ μικρό μέρος του συνολικού βάρους του λαδιού, περίπου το 2-5%. Πολλές μελέτες έχουν αποδείξει ότι οι βιοφαινόλες των ελαίων είναι υπεύθυνες για μια σειρά ευεργετικών για την ανθρώπινη υγεία χαρακτηριστικών. Κατά συνέπεια, το επιστημονικό και βιομηχανικό ενδιαφέρον επικεντρώθηκε στη διερεύνηση της χημικής σύνθεσης των φυτικών ελαίων και των βιολογικών ιδιοτήτων για την ανάπτυξη φαρμακευτικών και καλλυντικών προϊόντων. Ακολουθώντας τη ζήτηση της αγοράς για προϊόντα με φυσική προέλευση, είναι πολύ σημαντικό να σημειωθεί ότι ο σχεδιασμός δεν περιορίστηκε μόνο στη χρήση πρώτων υλών που προέρχονται από φυσικές πηγές, αλλά και στην επεξεργασία τους με πράσινες μεθοδολογίες. Τα τελευταία χρόνια, έχουν αναπτυχθεί πολλές φιλικές προς το περιβάλλον τεχνικές και έχουν βελτιστοποιηθεί για εφαρμογές στον τομέα των φυσικών προϊόντων. Οι μη τοξικοί διαλύτες, η χαμηλής ενέργειας και λιγότερο χρονοβόρες διαδικασίες εκχύλισης και απομόνωσης και η χρήση ανακυκλώσιμων/επαναχρησιμοποιήσιμων υποπροϊόντων είναι μερικά από τα κριτήρια που λαμβάνονται υπόψη για τη μετάβαση από την εργαστηριακή στην πιλοτική και βιομηχανική κλίμακα. Αυτά τα χαρακτηριστικά μπορούν να εκπληρωθούν μόνο από τεχνικές τελευταίας τεχνολογίας με πράσινο χαρακτήρα, όπως η φυγοκεντρική χρωματογραφία κατανομής και εκχύλισης, τα υπερκρίσιμα ρευστά σε συνδυασμό με τη χρήση βρώσιμων ή μη τοξικών αντιδραστηρίων. Μετά την εκχύλιση και τον διαχωρισμό, ένα άλλο σημαντικό βήμα είναι η βιολογική αξιολόγηση των εκχυλισμάτων και των καθαρών ενώσεων. Λόγω της αυξανόμενης οικολογικής συνείδησης των τελευταίων ετών, γίνεται μεγάλη προσπάθεια να αντικατασταθούν τα in vivo μοντέλα με in vitro πειράματα. Ο ερευνητικός άξονας της παρούσας διατριβής, βασίστηκε στην εξερεύνηση εννέα διαφορετικών ψυχρής έκθλιψης ελάιων. Η διατριβή χωρίζεται σε δύο διαφορετικά μέρη ανάλογα με τη σημασία και το μέγεθος της παραγωγής ή/και την κατανάλωση των φυτικών ελαίων. Δύο από αυτά, το σησαμέλαιο και το ελαιόλαδο, θεωρούνται ως παγκόσμια εμπορικά έλαια και μελετήθηκαν στο πρώτο μέρος της διατριβής. Στο δευτερό, μελετήθηκαν επτά σπορέλαια περιορισμένης παραγωγής. Αυτά τα έλαια προέρχονται από φυτά: μάραθο (Feniculum vulgare), κλίμα (Vitis vinifera), κολοκύθα (Cucurbita pepo), ηλίανθος (Helianthus annuus), αμυγδαλιά (Prunus dulcis), ροδιά (Punica granatum) και κάνναβη (Cannabis sativa) και παράγονται παγκοσμίως σε χαμηλές ποσότητες. Με βάση τα πιο πρόσφατα στοιχεία του Οργανισμού Γεωργίας Τροφίμων των Ηνωμένων Πολιτειών (FAO), η παγκόσμια παραγωγή σησαμιού και ελαιολάδου έφτασε τους 937.000 τόνους και 3.039.000 τόνους, αντίστοιχα. Και οι δύο, συνδέονται ευθέως με τις διατροφικές συνήθειες πολλών Αφρικανών, Ασιατικών και Ευρωπαϊκών πολιτισμών. Οι υψηλές διατροφικές τους ιδιότητες και οι ευρείες ιατρικές χρήσεις αποτέλεσαν το ερέθισμα για την περαιτέρω εκμετάλευση τους. Πολλές μελέτες υπογραμμίζουν τη σημασία αυτών των δύο ελαίων και των βιοδραστικών συστατικών τους για την ανθρώπινη υγεία. Αυτά τα ευρήματα πυροδοτούν την ανάγκη ανάπτυξης μεθοδολογιών για την ανάκτηση βιοδραστικών ενώσεων, γνωστών ως βιο-φαινολικό κλάσμα, από το σησαμέλαιο και το ελαιόλαδο σε επαρκείς ποσότητες, προκειμένου να καταστεί εφικτή μελέτη τους σε βάθος. Από όσα γνωρίζουμε, μέχρι τώρα δεν υπάρχει επιστημονική αναφορά στην πιλοτική παραγωγή βιο-φαινολικού κλάσματος ούτε για ελαιόλαδο, ούτε για σησαμέλαιο. Στο πρώτο μέρος αυτής της διατριβής, στόχος είναι η ανάπτυξη μεθοδολογιών εκχύλισης για την ανάκτηση φαινολικού κλάσματος από τα δύο έλαια, χρησιμοποιώντας πρωτοποριακές φυγοκεντρικές τεχνικές και την περαιτέρω κλασμάτωση και καθαρισμό των βιοδραστικών διαλυτών, κυρίως με υγρή-υγρή χρωματογραφία αντίστροφης ροής, σε ποσότητες που φτάνουν έως και γραμμάρια. Όσον αφορά το σησαμέλαιο, δύο σύγχρονες φυγοκεντρικές μέθοδοι εκχύλισης, το Annular Centrifugal Extaction (ACE) και το Centrifugal Partition Extaction (CPE), συγκρίθηκαν σε εργαστηριακή κλίμακα, με σκοπό να παραληφθεί το φαινολικό κλάσμα που είναι πλούσιο σε δύο λιγνάνια, την σησαμίνη και την σησαμόλη Για την κλασμάτωση του εκχυλίσματος και την απομόνωση της σησαμίνης και της σησαμολίνης σε καθαρή μορφή πάνω από 95%, εφαρμόστηκε ημι-παρασκευαστική χρωματογραφία φυγοκεντρικής κατανομής (CPC). Παράλληλα, τέσσερα άλλα λιγνάνια, η σαμίνη, η σησαμόλη , η σησαμινόλη και η επισησαμινόλη απομονώθηκαν σε υψηλή καθαρότητα. Όλα τα απομονωμένα λιγνάνια αξιολογήθηκαν ως προς τις δερμο-καλλυντικές τους ιδιότητες έναντι των ενζύμων τυροσινάσης, ελαστάσης, κολλαγενάσης και υαλουρονιδάσης. Επιπλέον, αυτή η μελέτη ενισχύθηκε με την ανάπτυξη μιας πρωτοποριακής μεθοδολογίας για την ανάκτηση εκχυλίσματος σησαμέλαιου σε πιλοτική κλίμακα, προκειμένου να καλυφθούν οι in vivo πειραματικές ανάγκες. Ο συνδυασμός φυγοκεντρικής εκχύλισης υγρού-υγρού σησαμέλαιο με το DMSO ως διαλύτη εκχύλισης, και τις ρητίνες προσρόφησης, που αναφέρεται για πρώτη φορά στην διατριβή αυτή, οδήγησε στην παραλαβή των κύριων λιγνανίων σε μεγάλες ποσότητες. Όσον αφορά το ελαιόλαδο, αναλύθηκαν αρκετά δείγματα και τα πλουσιότερα σε μόρια υψηλής προστιθέμενης αξίας όπως ελαιοκανθάλη (OLEO), ολεασίνη (OLEA), μονοαλδεϋδική μορφή άγλυκου ολευρωπείνης (MFOA), μονοαλδεϋδική μορφή άγλυκου λιγκστροσίδη (MFLA) και υδροξυτυρόλης (HT) επιλέχθηκαν για εκχύλιση. Για πρώτη φορά εφαρμόστηκε μια πειραματική διαδικασία πιλοτικής εκχύλισης του ελαιόλαδου σε φυγοκεντρικό εκχυλιστή. Τα αρχικά πειράματα εφαρμόστηκαν σε εργαστηριακής κλίμακας εξοπλισμό και στην συνέχεια σε πιλοτικό επίπεδο, παρέχοντας ένα εμπλουτισμένο βιο-φαινολικό εκχύλισμα εκατοντάδων γραμμαρίων. Η ανάλυση με Prep-CPC του εκχυλίσματος οδήγησε στην παραγωγή εμπλουτισμένων κλασμάτων με τις ουσίες στόχους. Επιπλέον, τα μόρια OLEO, OLEA, MFOA, MFLA και HT απομονώθηκαν από κλάσματα CPC σε υπερκάθαρη μορφή με την χρήση prep-HPLC-DAD. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας καθαρισμού των ενώσεων-στόχων, απομονώθηκαν τέσσερις μικρότερης συγκέντρωσης ουσίες, τρεις από τις οποίες είναι νέα φυσικά προϊόντα (EDA λακτόνη, (1R, 8Ε) -1-αιθοξυ- άγλυκο λιγκροσίδη και (1S, 8E) -1-αιθοξυ- άγλυκο λιγκροσίδη) και ένα ακόμη που απομονώνεται για πρώτη φορά από το ελαιόλαδο ((9E, 11E) -13-οκτατριδέκα-9,11-διενοικό οξύ). Το δεύτερο μέρος της διατριβής αναφέρεται σε επτά έλαια περιορισμένης παραγωγής ψυχρής έκθλιψης και τα αντίστοιχα υποπροϊόντά τους. Ένας εντελώς, πράσινος σχεδιασμός επιλέχθηκε για όλα τα στάδια της διαδικασίας. Με σκοπό να μειωθεί το οικολογικό αποτύπωμα, τα σπορέλαια εκλούστηκαν κατευθείαν σε ρητίνες και ελήφθησαν τα εκχυλίσματα τους, ενώ για τα υποπροϊόντά τους, πραγματοποιήθηκαν πειράματα εκχύλισης με υπερήχους (UΑΕ) και υπερκρίσιμη εκχύλιση ρευστών (SFE). Μη τοξικοί διαλύτες χρησιμοποιήθηκαν, όπως η αιθανόλη και το νερό, για την εκχύλιση με UΑΕ, ενώ η εκχύλιση SFE πραγματοποιήθηκε με CO2 και συν-διαλύτη αιθανόλη. Τα εκχυλίσματα αξιολογήθηκαν για την αντιοξειδωτική τους δράση και το συνολικό φαινολικό τους περιεχόμενο (TPC). Τέλος, προσδιορίστηκαν οι δερμο-καλλυντικές δράσεις κατά των ενζύμων κολλαγενάση, ελαστάση και τυροσινάση. Τα δύο πιο ενδιαφέροντα φυτικά έλαια και τα εκχυλίσματα των υποπροϊόντων τους (σταφύλι και μάραθο), διερευνήθηκαν περαιτέρω. Το εκχύλισμα ρητίνης σπόρου σταφυλιού και το εκχύλισμα υπερήχων πάστας σταφυλιού κλασματοποιήθηκαν με CPC. Όσον αφορά τα κλάσματα του CPC από το εκχύλισμα του σπόρου σταφυλιού, αξιολογήθηκαν κατά των ενζύμων τυροσινάσης, κολλαγενάσης και ελαστάσης. Το εκχύλισμα από τον σπόρο του μάραθου βρέθηκε πλούσιο σε ανηθόλη, μια βιοδραστική ένωση υψηλής σημασίας για τη βιομηχανία τροφίμων. Απομονώθηκε καθαρή ανηθόλη σε μεγάλη ποσότητα, ενώ παράλληλα εκλούστηκε ένα κλάσμα εμπλουτισμένο σε ισομερείς μορφές της 1- (4-μεθοξυφαινυλ) προπαν-1,2-διόλης. Η υπερκρίσιμη υγρή χρωματογραφία (SFC) επιλέχθηκε για τον πλήρη διαχωρισμό των ισομερών μορφών. Επιπλέον, άλλες ενώσεις ταυτοποιήθηκαν μετά την επεξεργασία παρασκευαστικής TLC των κλασμάτων του CPC. Ολοκληρώνοντας, η παρούσα διατριβή βασίστηκε σε μια προσπάθεια να συμβάλει στην υπάρχουσα γνώση για την οικολογική εκχύλιση και τη χρωματογραφική επεξεργασία βρώσιμων φυτικών ελαίων, με ευεργετικά για την υγεία αποτελέσματα. Νέες μεθοδολογίες εκχύλισης και διαχωρισμού αναπτύχθηκαν για την ανάκτηση υψηλής προστιθέμενης αξίας μορίων, από λάδια ευρέως διαδεδομένα λάδια όπως το σουσάμι και το ελαιόλαδο, με την εφαρμογή προηγμένων πράσινων τεχνικών. Ενώσεις υψηλού επιστημονικού ενδιαφέροντος απομονώθηκαν σε γραμμάρια, ενώ άλλες ουσίες απομονώθηκαν και αναφέρθηκαν για πρώτη φορά. Επιπλέον, σχεδιάστηκε μια ολιστική πράσινη στρατηγική για τον έλεγχο των εκχυλισμάτων από επτά ελαιόλαδα περιορισμένης παραγωγής (μάραθο, κλίμα, κολοκυθιά, ηλίανθο, αμύγδαλο, ροδιά και κάνναβη) τα αντίστοιχα υποπροϊόντα τους. Προτάθηκαν καινοτόμες μεθοδολογίες για τη διαχείριση των εννέα ελαίων, με ελάχιστο περιβαλλοντικό αποτύπωμα. Ο τελικός στόχος ήταν η δερμο-καλλυντική αξιολόγηση με ενζυματικές αναλύσεις των παραγόμενων εκχυλισμάτων και η περαιτέρω χημική διερεύνηση των πιο υποσχόμενων.
