Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Μπούμπας Δημήτριος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Θυφρονίτης Γεώργιος, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών κ Τεχνολογιών, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων
Καψογεώργου Ευσταθία, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Ρουμπελάκη Μαρία, Επίκουρη Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Εμμανουηλίδου Ευαγγελία, Επίκουρη Καθηγήτρια, Σχολή Θετικών Επιστημών, ΕΚΠΑ
Ξάνθου-Τσιγκόγλου Γεωργία, Β' Ερευνήτρια, ΙΙΒΕΑΑ
Βεκρέλλης Κωνσταντίνος, Β' Ερευνητής, ΙΙΒΕΑΑ
Περίληψη:
Εισαγωγή & Σκοπός: Τα βοηθητικά λεμφοκύτταρα τύπου 17 (Th17) παρουσιάζουν φαινοτυπική και λειτουργική ετερογένεια επιδεικνύοντας παθογενετικές και μη- παθογενετικές, ιστο- προστατευτικές λειτουργίες. Τα παθογενετικά Th17 κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη αυτοάνοσης φλεγμονής του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) και στην απομυελίνωση, στη σκλήρυνση κατά πλάκας (ΣΚΠ). Μέχρι και σήμερα, οι παράγοντες που εμποδίζουν την παθογενετική δράση των Th17 κυττάρων δεν έχουν καθοριστεί πλήρως. Η ακτιβίνη-Α είναι μια κυτταροκίνη που επιτελεί βασικές βιολογικές διεργασίες και επιδεικνύει προ- και αντι-φλεγμονώδεις δράσεις. Προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας, αποκάλυψαν ότι η ακτιβίνη-Α καταστέλλει τις Th2-μεσολαβούμενες αλλεργικές αποκρίσεις, σε ασθενείς με αλλεργικό άσθμα και προστατεύει από την ανάπτυξη άσθματος σε πειραματικά μοντέλα. Παρόλα αυτά ο ρόλος της ακτιβίνης-Α, στις αυτοάνοσες ανοσολογικές αποκρίσεις, που μεσολαβούνται από αυτοειδικά Th1 και Th17 κύτταρα, δεν έχει αποσαφηνιστεί. Στην παρούσα ερευνητική εργασία, υποθέσαμε ότι η ακτιβίνη-Α καταστέλλει την παθογενετική δράση των Th17 κυττάρων στην αυτοάνοση φλεγμονή που παρουσιάζεται στο ΚΝΣ και περιορίζει τη σοβαρότητα της νόσου. Σκοποί μας είναι: α) η μελέτη της δράσης της ακτιβίνης-Α στη ρύθμιση της παθογενετικής λειτουργίας των Th17 κυττάρων in vivo, και β) η διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που οδηγούν στην κατασταλτική δράση της ακτιβίνης-Α στα παθογενετικά Th17 κύτταρα.
Υλικά & Μέθοδοι: Ο in vivo ρόλος της ακτιβίνης-Α στη ΣΚΠ μελετήθηκε με θεραπευτική χορήγηση της ανασυνδιασμένης πρωτεΐνης στο πειραματικό μοντέλο της αυτοάνοσης πειραματικής εγκεφαλομυελίτιδας (ΠΑΕ), σε C57BL/6 ποντίκια, που αποτελεί ένα καθιερωμένο πειραματικό μοντέλο της ΣΚΠ. Η επίδραση της ακτιβίνης-Α στη ρύθμιση της παθογενετικής λειτουργίας των Th17 κυττάρων in vivo, μελετήθηκε με πειράματα μεταφοράς Th17 κυττάρων σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια Rag-/-, μετά την επαγωγή της ΠΑΕ. Μηχανιστικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν επίσης σε ποντίκια με έλλειψη του γονιδίου Nt5e-/- και Phd2-/-. Εξετάσθηκε ο ρόλος της ακτιβίνης-Α σε Th17 κύτταρα, διαφοροποιημένα υπό παθογενετικές συνθήκες (IL-6, IL-1β, IL-23), στην τροποποίηση του μεταγραφικού και φαινοτυπικού προφίλ των Th17 κυττάρων, με τεχνικές κυτταρομετρίας ροής, ELISA, qPCR, RNA-seq, ανοσοφθορισμού, κατακρήμνισης της χρωματίνης (ChIP) και συνεστιακή μικροσκοπία. Bιοπληροφορικές, πρωτεομικές και μεταβολικές αναλύσεις, εξέτασαν τους μοριακούς μηχανισμούς, μέσω των οποίων η ακτιβίνη-Α επηρεάζει τη διαφοροποίηση παθογενετικών Th17 κυττάρων. Μετρήθηκαν τα επίπεδα ακτιβίνης-Α σε ορό και εγκεφαλονωτιαίο υγρό ασθενών με ΣΚΠ, υποτροπιάζουσας μορφής (n=23), υγιών-μαρτύρων (n=10) και μαρτύρων με μη αυτοάνοση ασθένεια (n=11). Τέλος, διερευνήθηκε η δράση της ακτιβίνης-Α στη διαφοροποίηση ανθρώπινων Th17 κυττάρων και στις φλεγμονώδεις αποκρίσεις των CD4+T κυττάρων από ασθενείς με ΣΚΠ.
Αποτελέσματα: Τα ευρήματά μας έδειξαν ότι η θεραπευτική χορήγηση της ακτιβίνης-Α στην ΠΑΕ ελάττωσε τη σοβαρότητα της νόσου και περιόρισε την ανοσοπαθολογία του ΚΝΣ καθώς και την απομυελίνωση, μέσω κυρίως της μειωμένης ενεργοποίησης των παθογενετικών Th17 κυττάρων. Η διαφοροποίηση των Th17 κυττάρων παρουσία ακτιβίνης-Α κατέστειλε γονίδια που σχετίζονται με παθογενετικά Th17 κύτταρα όπως Ifng, Csf2, Il1b, Tbx21 και Batf, ενώ ταυτόχρονα οδήγησε σε σημαντική αύξηση γονιδίων που σχετίζονται με μη παθογενετικά Th17 κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των Il10, Maf και Ahr. Οι δράσεις αυτές της ακτιβίνης-Α πραγματοποιήθηκαν κυρίως μέσω του κύριου σηματοδοτικού μονοπατιού που περιλαμβάνει τον υποδοχέα ALK4 και τους μεταγραφικούς παράγοντες Smad2/3. Εκτεταμένες αναλύσεις του γονιδιώματος (RNAseq) καθώς και in vivo μελέτη, αποκάλυψαν ότι η ενεργοποίηση των CD39 και CD73 εκτονουκλεοτιδασών που τροποποιούν το ATP σε αδενοσίνη, είναι απαραίτητη για την κατασταλτική δράση της ακτιβίνης-Α τόσο στην παθογενετική ταυτότητα όσο και στις εγκεφαλοτοξικές λειτουργίες των Th17 κυττάρων. Όσον αφορά τους μοριακούς μηχανισμούς δράσης της ακτιβίνης-Α, δείξαμε ότι ο μεταγραφικός υποδοχέας, aryl hydrocarbon (Ahr), μαζί με τους STAT3 και c-Maf, επιστρατεύονται στους υποκινητές των γονιδίων Entpd1 και Nt5e (που κωδικοποιούν τις CD39 και CD73 εκτονουκλεοτιδάσες, αντίστοιχα) καθώς και της αντι-φλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-10, ελέγχοντας την έκφρασή τους στα Th17 κύτταρα. Δείξαμε επίσης, ότι η ακτιβίνη-Α ρυθμίζει αρνητικά την έκφραση και την πρωτεΐνική σταθερότητα του μεταβολικού παράγοντα, hypoxia-inducible factor-1-α (Hif1-α) καθώς και ποικίλες προ-φλεγμονώδεις πρωτεΐνες –κλειδιά που σχετίζονται με την παθογενετική δράση των Th17 κυττάρων. Τέλος δείξαμε ότι η ακτιβίνη-Α αυξάνεται στο ΚΝΣ ατόμων με ΣΚΠ και η παρουσία της έχει την ικανότητα να καταστέλλει τις φλεγμονώδεις Th17 μεσολαβούμενες κυτταρικές αποκρίσεις στους ασθενείς.
Συμπεράσματα: Τα παραπάνω ευρήματα αποκαλύπτουν την ακτιβίνη-Α, ως ένα νέο κρίσιμο ρυθμιστή της παθογενετικής δράσης των Th17 κυττάρων που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σα μόριο-στόχος για την καταστολή της αυτοάνοσης φλεγμονής στο ΚΝΣ.
