Μονάδα:
Τμήμα ΦαρμακευτικήςΒιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών
Ημερομηνία κατάθεσης:
2021-02-04
Συγγραφέας:
Φαντέλ Άννα-Μαρία
Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
ΕΜΜΑΝΟΥΗΛ ΜΙΚΡΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ, ΕΚΠΑ
ΑΝΔΡΕΑΣ ΠΑΠΑΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ, ΕΚΠΑ
ΠΑΝΑΓΙΩΤΗΣ ΜΑΡΑΚΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ, ΕΚΠΑ
ΠΟΥΛΗ ΝΙΚΟΛΑΪΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ– ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ, ΕΚΠΑ
ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ Ε. ΒΟΡΓΙΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΕΚΠΑ
ΚΟΛΟΚΟΥΡΗΣ ΑΝΤΩΝΗΣ , ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΚΠΑ
ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΜΥΡΙΑΝΘΟΠΟΥΛΟΣ , ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ, ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ, ΕΚΠΑ
Πρωτότυπος Τίτλος:
Ορθολογικός σχεδιασμός και ανάπτυξη αναστολέων των ενζύμων παραγωγής υδροθείου.
Γλώσσες διατριβής:
Ελληνικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
Ορθολογικός σχεδιασμός και ανάπτυξη αναστολέων των ενζύμων παραγωγής υδροθείου.
Περίληψη:
Το υδρόθειο H2S ανήκει στην οικογένεια των αέριων διαβιβαστών και χαρακτηρίζεται ως σημαντικός βιολογικός και φαρμακολογικός μεσολαβητής. Ενδογενώς στα κύτταρα των θηλαστικών το υδρόθειο παράγεται από τέσσερα ένζυμα τη β-Συνθετάση της Κυσταθειονίνης CBS, γ-Λυάση της Κυσταθειονίνης CSE, αμινοτρανσφεράση της κυστεΐνης CAT και 3-μερκαπτοπυροσταφυλική θειοτρανφεράση 3-MST. Το ένζυμο CBS είναι υπεύθυνο για το 20-75% του ενζυμικά παραγόμενου υδροθείου στον ανθρώπινο οργανισμό και έως 95% της παραγωγής στον εγκέφαλο. Η CBS εντοπίζεται στο κεντρικό νευρικό σύστημα καθώς και σε άλλους ιστούς (καρδιαγγειακού, γαστρεντερικού), ανήκει στην οικογένεια των PLP- εξαρτώμενων ενζύμων, περιέχει ένα μόριο φωσφορικής-5 ́-πυριδοξάλης ως συμπαράγοντα, και είναι το μοναδικό́ το οποίο περιέχει στη δομή του ένα μόριο αίμης. Το ανθρώπινο CBS είναι ένα ομοτετραμερές, αποτελούμενο από πολυπεπτιδικές αλυσίδες 63kDa και 551 αμινοξέων. Το ανθρώπινο ένζυμο CBS παρουσιάζει μια μοναδική πολύπλοκη δομή. Δομικά́ το ένζυμο CBS απαρτίζεται από́ τρεις υπομονάδες την υπομονάδα του N-τελικού́ άκρου, όπου συνδέεται ο συμπαράγοντας της αίμης και στη συνέχεια ακολουθεί ο κεντρικός καταλυτικός πυρήνας του ενζύμου. Στο C-τελικό άκρο του ενζύμου εντοπίζεται μια ρυθμιστική υπομονάδα αποτελούμενη από 140 αμινοξέα η οποία διαθέτει περιοχές πρόσδεσης μορίων S-αδενοσυλομεθειονίνης, η πρόσδεση των οποίων ενεργοποιεί αλλοστερικά την CBS. Οι περιοχές αυτές ονομάζονται CBS motifs. Πλήθος μελετών επιβεβαιώνουν. Μεγάλος αριθμός ερευνών επικεντρώνεται κυρίως στους μηχανισμούς και τις επιπτώσεις της αυξημένης ενεργότητας του ενζύμου CBS στον ανθρώπινο οργανισμό η οποία δείχνει να εμπλέκεται σε διάφορες μορφές καρκίνου. Αναλυτικότερα σε περιπτώσεις καρκίνου παχέος εντέρου και ωοθηκών, εμφανίζονται σημαντικά́ αυξημένα επίπεδα CBS. Οι πλέον αναγνωρισμένοι αναστολείς του ενζύμου CBS αμινοόξυ οξικό οξύ ΑΟΑΑ και υδροξυλαμίνη ΗΑ δεν παρουσιάζουν εκλεκτική ανασταλτική δράση έναντι του ενζύμου. Συμπερασματικά εκλεκτικοί αναστολείς του ενζύμου CBS μπορούν να χρησιμοποιηθούν τόσο στα πλαίσια διερεύνησης των σηματοδοτικών μονοπατιών του αέριου διαβιβαστή H2S στον ανθρώπινο οργανισμό, όσο και στην ανάπτυξη φαρμάκων αντιμετώπισης νόσων που συνδέονται με το H2S.
Η παρούσα έρευνα επικεντρώθηκε στην ανακάλυψη και το σχεδιασμό μορίων, με εκλεκτική ανασταλτική δράση έναντι του ενζύμου CBS μέσω της εφαρμογής in silico και in vitro πειραματικών μοντέλων. Για τη διεξαγωγή των in vitro πειραμάτων, σε πρώτο στάδιο οργανώθηκε η απομόνωση και ο καθαρισμός του ανθρώπινου ενζύμου CBS. Το ένζυμο CBS συνεκφράσθηκε με GST (GSH-S-transferase) και πολυιστιδινικό (Poly-hystidine, HIS) προσδέτη στο αμινοτελικό άκρο, καθώς και χωρίς προσδέτη. Στη παρούσα μελέτη διερευνήθηκαν εκτενώς, οι συνθήκες ετερόλογης έκφραση και καθαρισμού του ενζύμου CBS, εφαρμόσθηκαν χρωματογραφικές τεχνικές (χρωματογραφία συγγένειας, χρωματογραφία ιόντων, διήθηση πηκτής, χρωματογραφία υδρόφοβης αλληλεπίδρασης) με στόχο την λήψη απομονωμένου ενζύμου καθαρότητας <90%. Παράλληλα απομονώθηκε και η αλλοστερική περιοχή του ενζύμου CBS-motif.
Οργανώθηκαν in vitro δοκιμασίες υψηλής απόδοσης με εφαρμογή της χρωματομετρικής μεθόδου κυανού του μεθυλενίου. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του ενζυμικά παραγόμενου υδροθείου. Η ενεργότητα της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης υπολογίζεται βάση της ικανότητας παραγωγής αέριου υδροθείου παρουσία του συμπαράγοντα PLP και των υποστρωμάτων L-κυστεΐνης και ομοκυστεΐνης. Ελέγχθηκαν συνολικά περισσότερα από 800 συνθετικά μόρια ως πιθανή αναστολείς του ενζύμου CBS. Όλες οι ενώσεις που μελετήθηκαν επιλέχθηκαν από τη συλλογή μορίων του Τμήματος Φαρμακευτικής, Πανεπιστήμιο Αθηνών (~2K). Τα IC50 των πιο δραστικών μορίων-αναστολέων υπολογίσθηκαν μέσω δοσο-εξαρτώμενων πειραμάτων. Πυράζολοπυριδινικά ανάλογα έδειξαν ικανότητα αναστολής του ενζύμου CBS, με δράση ανάλογη με αυτή του γνωστού αναστολέα αμινοόξυ οξικό οξύ ΑΟΑΑ. Πιο συγκεκριμένα το IC50 του πυράζολοπυριδινικού αναστολέα 1116 υπολογίσθηκε στα 9.6μΜ και του ΑΟΑΑ στα 8.5μΜ. Το μόριο είναι προϊόν 1116 και δομικά διαφέρει με τους έως σήμερα βιβλιογραφικά διαθέσιμους αναστολείς του ενζύμου CBS. Αποτελείται από έναν πυραζολοπυριδινικό πυρήνα και τρεις χαρακτηριστικές ομάδες υποκαταστατών, δυο μεθυλο-πιπεραζίνες και ένα μεθοξυ-βενζυλο. Λόγω της δομικής συγγένειας του αναστολέα 1116 με τον αλλοστερικό ενεργοποιητή του ενζύμου S-αδενόσυλομεθειονίνης οργανώθηκαν πειράματα Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (DSF) στην αλλοστερική περιοχή του ενζύμου, ώστε να αποκλισθεί η πιθανότητα πρόσδεσης του αναστολέα στην ρυθμιστική περιοχή της CBS. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν δοσο-εξαρτώμενα πειράματα με 16 συνολικά πυράζολοπυριδινικά ανάλογα του μορίου 1116, 8 από τα οποία υπήρχαν ήδη στη χημειοθήκη και 8 νέα συντέθηκαν, έναντι του ενζύμου CBS. Τα IC50 των 16 αναλόγων του αναστολέα 1116 σε συνδυασμό με πειράματα εικονικής αξιολόγησης οδήγησαν στην εξαγωγή σχέσεων δομής-δράσης. Επιλέχθηκαν δυο κρυσταλλογραφίες του ανθρώπινου ενζύμου CBS, με αντίστοιχους κωδικούς 4PCU η οποία περιγράφει την τρισδιάστατη δομή του ενζύμου όπου έχει ενεργοποιηθεί αλλοστερικά μέσω πρόσδεσης μορίων S-αδενόσυλομεθειονίνης στη ρυθμιστική περιοχή και 1JBQ όπου απουσιάζουν τα CBS-motifs. Τα μόρια προσδέτες προετοιμάσθηκαν σε τρείς διαφορετικές καταστάσεις πρωτονίωσης και ακολούθησαν υπολογισμοί Πρόσδεσης Επαγόμενης Προσαρμογής (Induced Fit Docking IFD) βάση της πιθανής θέσης πρόσδεσης του μορίου οδηγού 1116 στο ενεργό κέντρο του ενζύμου CBS. Τέλος ακολούθησε ο υπολογισμός της ελεύθερης ενέργειας πρόσδεσης MM-GBSA του αναστολέα 1116 και των πυράζολοπυριδινικών αναλόγων. Συμπερασματικά, έπειτα από ανάλυση των σχέσεων δομής-δράσης και της προτεινόμενης θέσης πρόσδεσης του αναστολέα 1116 στο ενεργό κέντρο του ενζύμου CBS, ο πλευρικός υποκαταστάτης μέθυλοπιπεραζίνης της ανιλίνης εμφανίζεται ο πρώτος σε σειρά σημαντικότητας καθώς δείχνει να συμβάλει καταλυτικά στην ανασταλτική ικανότητα του μορίου 1116 έναντι του ανθρώπινου CBS.
Κύρια θεματική κατηγορία:
Θετικές Επιστήμες
Λοιπές θεματικές κατηγορίες:
Επιστήμες Υγείας
Λέξεις-κλειδιά:
β-Συνθετάση της κυσταθειονινης, Υδρόθειο, In vitro δοκιμασίες υψηλής απόδοσης, Διαφορική Φθορισμομετρία Σάρωσης, Αναστολείς , Πειράματα Εικονικής Αξιολόγησης, Υπολογισμοί Επαγόμενης Προσαρμογής Πρόσδεσης
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
6
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
147
