Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Εμμανουήλ Μικρός, Καθηγητής, Τμήμα Θετικών Επιστημών, ΕΚΠΑ
Ευάγγελος Γκίκας, Καθηγητής, Τμήμα Θετικών Επιστημών, ΕΚΠΑ
Ιωάννης Ντότσικας,Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Θετικών Επιστημών, ΕΚΠΑ
Ιωάννα Τζουλάκη, Επίκουρη Καθηγήτρια, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων/ Καθηγήτρια, Imperial College of London
Julian Griffin, Professor, Imperial College of London
Ευάγγελος Τέρπος, Καθηγητής, Τμήμα Επιστημών Υγείας, ΕΚΠΑ
Νικόλαος Θωμαΐδης
Καθηγητής, ΕΚΠΑ (ΜΕΛΟΣ)
Περίληψη:
Τα τελευταία χρόνια οι μελέτες συσχέτισης ολικού γονιδιώματος (GWAS) έχουν εντοπίσει μια πληθώρα γενετικών πολυμορφισμών που σχετίζονται με πολύπλοκες ασθένειες. Για έναν μικρό αριθμό γενετικών πολυμορφισμών, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους αυτοί συνδέονται με τη σχετιζόμενη ασθένεια είναι γνωστοί. Ωστόσο, για τη συντριπτική πλειοψηφία αυτών παραμένουν σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητοι. Επιπλέον, τα μεγέθη επίδρασης των γενετικών συσχετίσεων με ασθένειες είναι γενικά μικρά και απαιτούν κοόρτες με πολύ μεγάλο μέγεθος πληθυσμού. Για τους λόγους αυτούς, τα ευρήματα των GWAS δεν έχουν οδηγήσει σε σημαντικές βελτιώσεις στην κλινική διαχείριση των σχετιζόμενων νόσων. Οι κλασικές GWAS μελέτες έχουν επεκταθεί σε μελέτες συσχέτισης με ενδιάμεσα χαρακτηριστικά, όπως η έκφραση RNA ή μεταβολίτες που είναι γνωστοί παράγοντες κινδύνου της εξεταζόμενης νόσου (όπως τα επίπεδα τριγλυκεριδίων ή γλυκόζης). Τα χαρακτηριστικά αυτά εμφανίζουν μεγαλύτερα μεγέθη επίδρασης καθώς βρίσκονται πιο κοντά στο κλινικό αποτέλεσμα σε σύγκριση με τον γονότυπο. Την τελευταία δεκαετία, η μεταβολομική έχει αναδυθεί ως ένα ισχυρό εργαλείο για την ενδελεχή μέτρηση των μεταβολιτών, δηλαδή μορίων χαμηλού μοριακού βάρους, στα βιολογικά υγρά, επιτρέποντας την ταυτόχρονη ανίχνευση και ποσοτικοποίηση μιας ποικιλίας μικρών μορίων με διαφορετικές χημικές ιδιότητες και δομές. Μια άλλη σημαντική πτυχή της μεταβολομικής είναι ότι το μεταβόλωμα αντανακλά την επίδραση τόσο των ενδογενών όσο και των εξωγενών εκθέσεων. Ως εκ τούτου, επιτρέπει τη διερεύνηση τόσο των γενετικών όσο και των περιβαλλοντικών επιπτώσεων στον κλινικό φαινότυπο. Πρόσφατες μελέτες έχουν διερευνήσει τη συσχέτιση δεδομένων GWAS με δεδομένα μεταβολομικής, γνωστές ως μελέτες συσχέτισης ολικού γονιδιώματος με συγκεντρώσεις μεταβολιτών (mGWAS).
Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να εφαρμόσει μια στρατηγική ανάλυσης συσχέτισης ολικού μεταβολώματος (ΜWAS) με γενετικές παραλλαγές που έχουν προηγουμένως συσχετισθεί με μια συγκεκριμένη σύνθετη ασθένεια, όπως διάφοροι τύποι καρκίνου και καρδιαγγειακές νόσοι, προκειμένου να διερευνηθούν διεξοδικά οι αλληλεπιδράσεις γονιδίων-μεταβολιτών και να αποκαλυφθούν υποκείμενες μεταβολικοί οδοί της νόσου στο αγνωστικιστικό πλαίσιο των GWAS μελετών. Εξετάσθηκε η συσχέτιση γενετικών παραλλαγών που έχουν προηγουμένως συνδεθεί με τρεις σύνθετες ασθένειες, καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC), πολλαπλό μυέλωμα (MM) και υψηλή αρτηριακή πίεση (BP), με μεταβολίτες ως ενδιάμεσα χαρακτηριστικά, εφαρμόζοντάς μια μεταβολομική προσέγγιση μέσω φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR) σε μια μεγάλη ομάδα πληθυσμού του Ηνωμένου Βασιλείου. Πιο συγκεκριμένα, αναλύθηκαν τα δεδομένα GWAS, καθώς και τα δεδομένα NMR ούρων και αίματος από 1,974 συμμετέχοντες στη Μελέτη Παρακολούθησης Της Υγείας των Ραδιοκυμάτων (ΑΙRWAVE). Αρχικά πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μεθοδολογίας, τονίζοντας την ανάγκη για ταυτόχρονη εφαρμογή τόσο στοχοθετημένων όσο και μη στοχευμένων προσεγγίσεων μεταβολομικής. Εξετάστηκε επίσης η χρήση πολυμεταβλητών προσεγγίσεων, η οποία δεν έχει ακόμη διερευνηθεί και καθιερωθεί σε αυτού του είδους τις μελέτες. Η χρήση των πολυμεταβλητών προσεγγίσεων είναι υψηλής σημασίας προκειμένου να ληφθούν υπόψη οι δομές εξάρτησης στα δεδομένα omics. Ένα άλλο πλεονέκτημα αυτής της μελέτης είναι η ταυτόχρονη ανάλυση δειγμάτων πλάσματος και ούρων, καθώς το μεταβόλωμα των ούρων παραμένει σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητο στο πλαίσιο των GWAS. Πραγματοποιήσαμε απόδοση κορυφών και ταυτοποίηση των μεταβολιτών στα φάσματα NMR των ούρων για την AIRWAVE, χρησιμοποιώντας πειράματα 2D NMR, στατιστικές προσεγγίσεις (π.χ. στατιστική φασματοσκοπία συνολικής συσχέτισης-STOCSY), καθώς και πειράματα εμβολιασμού δειγμάτων με πρότυπες ουσίες. Με βάση την ανάπτυξη μεθοδολογίας, για κάθε γενετικό πολυμορφισμό πραγματοποιήθηκε ανάλυση μερικής συσχέτισης Spearman των δεδομένων NMR. Όλες οι μονομεταβλητές αναλύσεις προσαρμόστηκαν για συγχυτικούς παράγοντες (confounders) και διορθώθηκαν για 5% Ποσοστό Ψευδών Ανακαλύψεων (False Discovery Rate) (μη στοχευμένη προσέγγιση) ή στο 5% Bonferroni (στοχευμένη προσέγγιση). Χρησιμοποιήσαμε επίσης τους λόγους των μεταβολιτών, οι οποίοι έχει βρεθεί ότι αυξάνουν τη συσχέτιση για ένα ζεύγος προϊόντος-υποστρώματος. Χρησιμοποιήθηκαν επίσης πολυμεταβλητές προσεγγίσεις, όπως η ανακάλυψη γνώσης με μεγιστοποίηση της ακρίβειας (KODAMA) και η σποραδική παλινδρόμηση μερικών ελάχιστων τετραγώνων (SPLS) προκειμένου να διερευνηθεί η σχέση των γενετικών πολυμορφισμών και των μεταβολικών χαρακτηριστικών σε ένα πολυμεταβλητό πλαίσιο. Για την ανάλυση του CRC και της BP, όπου είναι γνωστό ότι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση των νόσων αυτών, διερευνήσαμε τις αλληλεπιδράσεις με διαιτητικούς παράγοντες, ενώ κατασκευάστηκαν επίσης δίκτυα γονιδίων-μεταβολιτών-διατροφής χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Cytoscape και «ανάλυση ενοποίησης δεδομένων για την ανακάλυψη βιοδεικτών χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις λανθανουσών μεταβλητών για μελέτες Omics» (DIABLO) αντίστοιχα. Στα δείγματα ορού, συμπληρωματικά της προσέγγισης NMR, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα Φασματομετρίας Μάζας (MS) από την πλατφόρμα Metabolon για στοχευμένη ανάλυση. Στην ανάλυση του CRC, πραγματοποιήθηκε ανάλυση μενδελιανής τυχαιοποίησης (MR) για να διαπιστωθεί η σχέση αιτίου-αιτιατού των σημαντικών μεταβολιτών στην αύξηση του κινδύνου για CRC.
Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι υπάρχει συσχέτιση μεταξύ του γονότυπου και του μεταβολώματος για τις εξεταζόμενες νόσους. Στην ανάλυση του CRC, ένας μεγάλος αριθμός μεταβολιτών έδειξε ισχυρή συσχέτιση με γενετικούς πολυμορφισμούς, μεταξύ των οποίων σάκχαρα (σακχαρόζη, γλυκόζη), αμινοξέα (τυροσίνη, λευκίνη, λυσίνη, γλουταμίνη), μεταβολίτες του εντερικού μικροβιώματος (θειικό άλας π-κρεσόλης, Ν-οξείδιο της τριμεθυλαμίνης (TMAO)), καθώς και λιπίδια και σωματίδια λιποπρωτεΐνων. Μεταξύ των γενετικών πολυμορφισμών που έδειξαν συσχέτιση με το μεταβόλωμα ήταν οι rs10411210 στο γονίδιο Rhophillin Binding Protein 2 (RHPN2), rs78368589 στο γονίδιο Solute Carrier Family 6 Μember 18 (SLC6A18) και rs745213 στο γονίδιο Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase 5 (MAP2K5) στην ανάλυση των μεταβολιτών στα δείγματα ούρων και rs174533 στο γονίδιο Myelin Regulator Factor (MYRF) στην ανάλυση των μεταβολιτών του αίματος. Ένα από τα σημαντικότερα ευρήματά μας ήταν η συσχέτιση του rs10411210 με τα επίπεδα σακχαρόζης στα ούρα. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν μια σχέση μεταξύ του RHPN2 και της έκφρασης της σουκράσης-ισομαλτάσης (SI) μέσω της ενεργοποίησης της Ροφιλλίνης Α, η οποία οδηγεί περαιτέρω σε μειωμένα επίπεδα σακχαρόζης στα ούρα. Ο ρόλος της SI στον CRC είναι ήδη γνωστός, ωστόσο από όσο γνωρίζουμε δεν υπάρχει μελέτη που να συνδέει τα επίπεδα σακχαρόζης των ούρων με τον κίνδυνο ανάπτυξης CRC. Επιπλέον, στη μελέτη αυτή προτείνονται νέοι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους οι μεταβολίτες του μικροβιώματος του εντέρου, το TMAO και το θειικό άλας της π-κρεσόλης, εμπλέκονται στην παθογένεση του CRC. Τέλος, μεταξύ των παραγόντων του τρόπου ζωής, η κατανάλωση αλκοόλ παρουσίασε τις πιο ισχυρές συσχετίσεις με τους περισσότερους από τους σημαντικούς μεταβολίτες.
Στην ανάλυση του MM, αναδείχθηκε η συσχέτιση διάφορων μεταβολιτών με τους γενετικούς πολυμορφισμούς που έχουν συνδεθεί με το ΜΜ. Μεταξύ των σημαντικότερων ευρημάτων ήταν η συσχέτιση του rs139371 στο γονίδιο Chromobox Protein Homolog 7 (CBX7), με τα επίπεδα τυροσίνης στα ούρα. Το γονίδιο αυτό έχει συνδεθεί στο παρελθόν τόσο με ΜΜ όσο και με καρκίνο του θυρεοειδούς, παρέχοντας νέα στοιχεία σχετικά για την επίδραση των θυρεοειδικών ορμονών στον καρκίνο. Επιπλέον, η συσχέτιση του λόγου Ν,Ν-διμέθυλογλυκίνη/γλυκίνη με τον γενετικό πολυμορφισμό rs58618031 στο γονίδιο Protection of telomeres protein 1 (POT1) ανέδειξε το ρόλο του μεταβολισμού της ομοκυστεΐνης στη διαδικασία σύντμησης των τελομερών. Το αποτέλεσμα αυτό έδειξε επίσης της σημασία που έχει η χρήση των λόγων των μεταβολιτών στις μελέτες ΜWAS για την ανάδειξη νέων συσχετίσεων. Σε ακόλουθη μελέτη, πραγματοποιήσαμε ανάλυση μεταβολομικής με ΝΜR σε ασθενείς με MM, προκειμένου να αναζητήσουμε μεταβολικούς δείκτες που θα μπορούσαν να διαχωρίσουν τους ασθενείς με MM που ανταποκρίνονται στη θεραπεία με μονοκλωνικά αντισώματα από εκείνους που δεν ανταποκρίνονται. Συλλέχθηκε πλάσμα περιφερικού αίματος (PB) και μυελού των οστών (BM) από ασθενείς με MM κατά τη στιγμή της διάγνωσης (Baseline-BL) και μετά τη θεραπεία. Αυτή η μελέτη κατέδειξε το ρόλο του μεταβολισμού του γλουταμινικού οξέος και της γλουταμίνης τόσο στο PB όσο και στο BM των ασθενών με MM, ενώ οι μεταβολές στο BM ήταν πολύ ισχυρότερες από εκείνες που αναφέρθηκαν στο PΒ. Επισημάνθηκε επίσης ο ρόλος πολλών αμινοξέων, συμπεριλαμβανομένης της τυροσίνης και των αμινοξέων διακλαδισμένης αλυσίδας που προέκυψαν και στην ανάλυση ΜWAS. Τέλος, το γαλακτικό οξύ αναδύθηκε ως κύριος μεταβολίτης για την πρόγνωση των ασθενών με MM, ενώ άλλα οργανικά οξέα (οξικό, πυροσταφυλλικό και κιτρικό οξύ) είχαν επίσης μεγάλο ρόλο στην διάκριση των ασθενών με βάση την απόκριση τους στη θεραπεία.
Στην ανάλυση της BP εξετάστηκαν πάνω από 1000 γενετικoί πολυμορφισμοί για συσχετίσεις με μεταβολικούς δείκτες στα ούρα. Μεταξύ των πιο ισχυρών συσχετίσεων ήταν αυτή του πολυμορφισμού rs1047891 στο γονίδιο Carbamoyl-Φωσφορική Συνθάση 1 (CPS1) με τα επίπεδα γλυκίνης, κρεατίνης και γουανιδοοξικού οξέος στο αίμα και τα ούρα. Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί ένα ένζυμο υπεύθυνο για τη ρύθμιση του κύκλου της ουρίας. Αν και η συσχέτιση μεταξύ του CPS1 και των επιπέδων γλυκίνης στο αίμα ήταν ήδη γνωστή, εντοπίστηκαν και άλλοι μεταβολίτες εμπλεκόμενοι στην προτεινόμενη βιολογική οδό, ενώ δείξαμε ότι η συσχέτιση αυτή απεικονίζεται σε μικρότερο βαθμό στα επίπεδα των μεταβολιτών στα ούρα. Πληθώρα άλλων γενετικών πολυμορφισμών παρουσίασαν επίσης συσχετίσεις με μεταβολίτες στα ούρα, κυρίως μεταβολίτες που σχετίζονται με το μικροβίωμα του εντέρου, όπως το ιππουρικό οξύ, το TMAO και το 3-(3-υδροξυφαινυλ)-3-υδροξυπροπιονικό οξύ, καθώς και μεταβολίτες που σχετίζονται με τον καφέ, όπως το οξύ τoυ Sumiki, η τριγoνελλίνη και το Ν-μεθυλοπυριδίνιο. Τέλος, η πολυμεταβλητή ανάλυσή DIABLO, η οποία χρησιμοποιήθηκε για την ενοποίηση των δεδομένων GWAS, μεταβολομικής και διατροφής στην πρόβλεψη των αποτελεσμάτων BP (συστολική και διαστολική BP), τόνισε το ρόλο του φύλου και της κατανάλωσης αλκοόλ στην υπέρταση.
Συνολικά, στη μελέτη αυτή αναδείχθηκαν μεταβολίτες και γενετικοί πολυμορφισμοί που εμπλέκονται στην παθολογία των εξεταζόμενων ασθενειών παρέχοντας νέες γνώσεις για τους μοριακούς μηχανισμούς του καρκίνου και της BP και ανοίγοντας το δρόμο για νέες θεραπευτικές ή προληπτικές στρατηγικές για αυτές τις ασθένειες. Ωστόσο, θα πρέπει να ακολουθήσει επαλήθευση των αποτελεσμάτων με in vivo/ in vitro μελέτες προκειμένου να προκύψουν περισσότερα στοιχεία για τις προτεινόμενες μοριακές οδούς, καθώς και αναπαραγωγή των αποτελεσμάτων (replication) σε ανεξάρτητες κοόρτες.
