Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Γεώργιος Διαλλινάς, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Σπυρίδων Ευθυμιόπουλος, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Παναγιώτης Πολίτης, Ερευνητής Β, Ι.ΙΒ.Ε.Α.Α.
Παναγιώτα Παπαζαφείρη, Αναπλ. Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Δήμητρα Θωμαΐδου, Ερευνήτρια, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Ευαγγελία Εμμανουηλίδου, Επικ. Καθηγήτρια, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ
Ιωάννης Σεραφειμίδης, Ερευνητής Γ, Ι.ΙΒ.Ε.Α.Α.
Περίληψη:
Με την έλευση και διάδοση των τεχνολογιών αλληλούχισης νέας γενιάς, ένας αυξανόμενος αριθμός πρώην άγνωστων ρυθμιστικών ειδών RNA έχει έρθει στο προσκήνιο. Μεταξύ αυτών, βρέθηκαν μακρά RNA μόρια που δεν κωδικοποιούν για πρωτεΐνες (long non-coding RNAs – lncRNAs), τα οποία συμμετέχουν στον έλεγχο της πολυδυναμίας των βλαστικών κυττάρων, την καρκινογένεση, την ανάπτυξη και τη λειτουργία πολλών ιστών και οργάνων. Παρόλο που χιλιάδες lncRNAs εκφράζονται στον εγκέφαλο των ενήλικων θηλαστικών με ειδικά και συγκεκριμένα μοτίβα έκφρασης, παραμένουν ελάχιστα αναγνωρισμένα και χαρακτηρισμένα, ενώ οι ρόλοι τους στην ανάπτυξη του εγκεφάλου δεν έχουν ακόμη μελετηθεί.
Η αντίληψη ότι το γονιδίωμα ασκεί τις λειτουργίες του μόνο μέσω πρωτεϊνών και τυπικών γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες εμφανίζεται προοδευτικά ως μια μάλλον αφελής απλοποίηση ενός σύνθετου και γοητευτικού συστήματος που βρίθει βρόγχων και δικτύων και που περιλαμβάνει επίσης μόρια RNA εκτός από πρωτεΐνες. Πράγματι, η γνώση μας για τη δραστηριότητα, τη ρύθμιση και την αρχιτεκτονική των γονιδιωμάτων των θηλαστικών έχει αναβαθμιστεί πλήρως μετά από τις τελευταίες εξελίξεις στις τεχνολογίες αλληλούχισης και στα δεδομένα που αποκτήθηκαν από μελέτες μεγάλης κλίμακας όπως το ENCODE και το FANTOM. Επιπλέον, οι συγκρίσεις μεταξύ μεταγραφωμάτων και γονιδιωμάτων θηλαστικών έχουν δείξει ότι περίπου τα δύο τρίτα του γονιδιωματικού DNA μεταγράφονται, αλλά μόνο λιγότερο από το 2% μεταφράζεται τελικά σε πρωτεΐνες. Επιπλέον, ακόμη και αν ληφθούν υπόψη τα παράγωγα που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα και από μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις, το επίπεδο της πολυπλοκότητας των οργανισμών μεταξύ των ευκαρυωτικών συσχετίζεται καλύτερα με το κλάσμα των RNAs που δεν κωδικοποιούν για πρωτεΐνες παρά με το άθροισμα των γονιδίων που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες.
Εκτός από την ήδη γνωστή πληθώρα και πολυπλοκότητα που επιτυγχάνεται από τα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες, τα ρυθμιστικά τους στοιχεία και τις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις, έχει αναγνωριστεί ένας εκπληκτικός αριθμός μη κωδικοποιητικών RNA (ncRNAs). Αυτά τα ncRNAs ταξινομούνται σε μικρά (scnRNAs) και μακριά (lncRNAs) μη κωδικοποιητικά RNA, τα οποία διαφέρουν κυρίως σε μέγεθος, αλλά και σε λειτουργία. Τα περισσότερα από τα sncRNA λειτουργούν ως ρυθμιστές σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο στο κυτταρόπλασμα, ενώ τα lncRNAs δρουν σε ένα πιο ευρύ και ποικίλο εύρος λειτουργιών. Στην πραγματικότητα, διαπιστώθηκε ότι οι ρυθμιστικοί μηχανισμοί που περιλαμβάνουν lncRNAs επηρεάζουν εκτενώς τη γονιδιακή ρύθμιση μεμονωμένων γονιδίων και γονιδιακών δικτύων σε μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό επίπεδο. Επομένως, τα lncRNAs παρέχουν στα κύτταρα ένα επιπλέον εργαλείο για τον έλεγχο της χωροχρονικής ρύθμισης των γονιδίων, μια κρίσιμη απαίτηση για τα νευρικά βλαστικά κύτταρα κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου.
Ο κύριος στόχος αυτής της διδακτορικής διατριβής είναι η καλύτερη κατανόηση της εμπλοκής των lncRNAs στην ανάπτυξη του εγκεφάλου των θηλαστικών και ειδικά στα γονιδιακά ρυθμιστικά δίκτυα που ορίζουν την ταυτότητα των νευρικών βλαστικών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, οι συγκεκριμένοι στόχοι αυτής της διατριβής περιλαμβάνουν:
α) Ταυτοποίηση lncRNAs που εκφράζονται σε νευρικά κύτταρα και χαρακτηρισμός των αλλαγών στο προφίλ έκφρασης αυτών των lncRNAs κατά την ανάπτυξη εγκεφάλου μυός (και πιο συγκεκριμένα του τελεγκεφάλου).
β) Αξιολόγηση της σημαντικότητας των lncRNAs που προσδιορίστηκαν στον προηγούμενο στόχο και συγκεκριμένα αν απαιτούνται για την ανάπτυξη του εγκεφάλου μυός. Εδώ σκοπεύουμε να εξετάσουμε με συνολικό τρόπο το ρόλο των lncRNAs που προέκυψαν από τον προηγούμενο στόχο στον έλεγχο των ιδιοτήτων των νευρικών βλαστικών κυττάρων μυός. Έχουμε αναπτύξει πειραματικά συστήματα για την απομόνωση, την καλλιέργεια και τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων από το εμβρυϊκό κεντρικό νευρικό σύστημα μυών και έχουμε χρησιμοποιήσει αυτά τα συστήματα για να μελετήσουμε τους μοριακούς μηχανισμούς που ελέγχουν τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, την κυτταρική εξειδίκευση και τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων. Αυτός ο στόχος περιλαμβάνει δύο συγκεκριμένους υπο - στόχους:
1: Υπερέκφραση επιλεγμένων lncRNAs και ανάλυση της επίδρασης της υπερέκφρασής τους σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρικών βλαστικών κυττάρων.
2: Αποσιώπηση επιλεγμένων lncRNAs χρησιμοποιώντας ένα σύστημα CRISPR-dCas9-KRAB και ανάλυση της επίδρασης της αποσιώπησής τους σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρικών βλαστικών κυττάρων.
Ο απώτερος στόχος αυτής της διατριβής είναι να παρέχει πληροφορίες για τη συμμετοχή των lncRNAs στην οργανογένεση και να συμβάλλει στην κατανόηση του τρόπου με τον οποίο τα lncRNAs και τα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες σχηματίζουν ρυθμιστικά δίκτυα με σημαντικές λειτουργίες στα νευρικά κύτταρα. Η κατανόηση του ρόλου των lncRNAs στην οργανογένεση του εγκεφάλου θα μπορούσε να επιφέρει σημαντικότατες προσθήκες στις βασικές αρχές της αναπτυξιακής / κυτταρικής βιολογίας και της νευροεπιστήμης.
Για να αντιμετωπίσουμε λοιπόν το βασικό μας ερώτημα, αρχικά πραγματοποιήσαμε RNA-Seq ανάλυση στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα εμβρύων μυός. Με βάση αυτήν την ανάλυση, εντοπίσαμε πολλά lncRNAs με υψηλά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε κύτταρα του νευρικού συστήματος. Εστιάσαμε σε lncRNAs, τα οποία μεταγράφονται από γονιδιωματικούς τόπους σε κοντινή απόσταση με γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες και πιο συγκεκριμένα, σε κοντινή απόσταση με γονίδια που κωδικοποιούν για μεταγραφικούς παράγοντες με κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του εγκεφάλου. Βασιζόμενοι και στη σχετική βιβλιογραφία που πρότεινε ως πιθανό μηχανισμό δράσης των lncRNAs την in cis επίδρασή τους σε διπλανά γονίδια, υποθέσαμε ότι αυτά τα lncRNAs μπορεί να εμπλέκονται στη ρύθμιση των γειτονικών τους γονιδίων που κωδικοποιούν για σημαντικούς μεταγραφικούς παράγοντες.
Για να ελέγξουμε αυτήν την αρχική μας υπόθεση, μελετήσαμε τις αλλαγές στα προφίλ έκφρασης κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου μυός ενός αριθμού ζευγαριών lncRNAs και γειτονικών γονιδίων για μεταγραφικούς παράγοντες με real time-qPCR. Από αυτήν τη μελέτη, προέκυψαν ενδιαφέροντα τέτοια ζεύγη, τα οποία αναλύσαμε περαιτέρω με in situ υβριδισμούς σε ιστούς διάφορων αναπτυξιακών σταδίων εμβρυικού εγκεφάλου μυός και κατόπιν υπερέκφρασης των εν λόγω lncRNAs στην κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος Ν2Α. Αυτά τα πειράματα, έδωσαν αρκετές πληροφορίες, ώστε αρχικά να εστιάσουμε το ενδιαφέρον μας στο lncRNA TCONS_00034309, που ονομάστηκε από εμάς ως Lacuna. Επομένως, συνεχίσαμε με ex vivo μελέτες υπερέκφρασης και αποσιώπησης του Lacuna σε νευρικά βλαστικά κύτταρα, ώστε να μελετήσουμε το λειτουργικό ρόλο του στη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων και τη σχέση του με το μεταγραφικό παράγοντα Tbr2 ή Eomes, έναν κρίσιμο ρυθμιστή της νευρογένεσης και συγκεκριμένα της μετάβασης από ενδιάμεσο προγονικό κύτταρο σε μετα-μιτωτικό νευρώνα.
Πιο συγκεκριμένα, το γονίδιο που κωδικοποιεί για το Lacuna βρίσκεται στο χρωμόσωμα 9, μόνο περίπου 1kb μακριά από το γονίδιο που κωδικοποιεί για το μεταγραφικό παράγοντα Tbr2 / Eomes. Το μετάγραφο αποτελείται από 3 εξώνια και έχει συνολικό μήκος 1661 νουκλεοτιδίων, όπως επιβεβαιώνεται από τη στρατηγική χαρτογράφησης που ακολουθήσαμε. Το Lacuna εκφράζεται διαφορικά στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο μυός με υψηλότερη έκφραση κατά τη διάρκεια των εμβρυϊκών ημερών Ε15 και Ε16. Οι in situ υβριδισμοί που πραγματοποιήσαμε για το Lacuna σε ιστούς εμβρυικού εγκεφάλου μυός έδειξαν ειδική έκφραση στην κοιλιακή στιβάδα και στη φλοιική πλάκα του αναπτυσσόμενου φλοιού εγκεφάλου μυός. Η υποκυτταρική κλασμάτωση των νευρικών βλαστικών κυττάρων και η επακόλουθη real time-qPCR αποκάλυψαν ότι το Lacuna βρίσκεται τόσο στο κυτοσόλιο όσο και στον πυρήνα, υποδηλώνοντας την πιθανότητα να λειτουργεί τόσο in cis όσο και in trans.
Για να αποσαφηνίσουμε περαιτέρω το λειτουργικό ρόλο του Lacuna, χρησιμοποιήσαμε ένα σύστημα καλλιέργειας για πρωτογενή νευρικά βλαστικά / προγονικά κύτταρα, όπου τα προγονικά / βλαστικά κύτταρα απομονώνονται από φλοιούς εμβρυικών εγκεφάλων μυός κατά την εμβρυική ημέρα Ε14.5 και στη συνέχεια, καλλιεργούνται κατάλληλα για να σχηματίσουν νευροσφαίρες. Παρουσία αυξητικών παραγόντων, τα νευρικά βλαστικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται, ενώ απουσία αυξητικών παραγόντων, διαφοροποιούνται σε νευρώνες και αστροκύτταρα. Χρησιμοποιώντας αυτό το σύστημα καλλιέργειας και μετά από υπερέκφραση του lncRNA Lacuna και ανοσοφθορισμούς, είδαμε ότι η νευρογένεση μειώνεται σημαντικά (δείκτες β-III τουμπουλίνη και NeuN) και ο πληθυσμός Olig2+ αυξάνεται στα κύτταρα που υπερεκφράζουν το Lacuna σε σύγκριση με τις καλλιέργειες ελέγχου. Από την άλλη πλευρά, η αστρογλοιογένεση δεν φαίνεται να επηρεάζεται, καθώς και ο πολλαπλασιασμός (δείκτης BrdU +) και η απόπτωση (δείκτης διασπασμένης κασπάσης 3), αλλά η νεστίνη, ένας δείκτης της πολυδυναμίας των νευρικών βλαστικών κυττάρων, αυξάνεται. Επιπλέον, ο πληθυσμός των κυττάρων που είναι TBR2 / EOMES + και η γονιδιακή έκφραση του παράγοντα Tbr2 / Eomes δεν επηρεάζονται από την υπερέκφραση του Lacuna, γεγονός που υποδηλώνει ότι η επίδραση του Lacuna στις διαδικασίες της νευρογένεσης είναι ανεξάρτητη από το Tbr2 και υπαινίσσεται μια πιθανή in trans δράση του lncRNA Lacuna.
Για να διαλευκάνουμε περαιτέρω το ρόλο του Lacuna στη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων, πραγματοποιήσαμε πειράματα αποσιώπησης του Lacuna στο ίδιο σύστημα καλλιέργειας, χρησιμοποιώντας ένα CRISPR-dCas9-KRAB Effector Σύστημα για την καταστολή της μεταγραφής του Lacuna. Αυτό το σύστημα είναι πολύ αποτελεσματικό στην αποσιώπηση γονιδίων που κωδικοποιούν για lncRNAs και επιλύει το ζήτημα αν τα παρατηρούμενα φαινόμενα αυτών των αποσιωπήσεων είναι αποτέλεσμα της απουσίας του lncRNA μορίου ή του αντίστοιχου DNA. Ο μηχανισμός δράσης αυτού του συστήματος δεν επηρεάζει καθόλου την DNA αλληλουχία. Η dCas9 μαζί με το μεταγραφικό καταστολέα KRAB οδηγούνται στο γονίδιο επιλογής από ειδικά σχεδιασμένα gRNA μόρια και έτσι επιτυγχάνεται η καταστολή της μεταγραφής του γονιδίου επιλογής. Αφού επιβεβαιώσαμε την αποτελεσματικότητα της τεχνικής (το Lacuna καταστέλλεται σημαντικά), επαληθεύσαμε επίσης ότι το σύστημα δεν επηρεάζει γενικά το γενετικό τόπο (τα γειτονικά γονίδια Golga4 και Gm33460 δεν επηρεάζονται). Αντιθέτως, η αποσιώπηση του Lacuna σε νευρικά βλαστικά κύτταρα παρουσία αυξητικών παραγόντων οδηγεί σε δραματική μείωση της έκφρασης του γονιδίου Tbr2 / Eomes, γεγονός που υποδηλώνει ότι το Lacuna είναι απαραίτητο για την έκφραση του Tbr2 / Eomes σε νευρικά βλαστικά κύτταρα.
Επιπλέον, απουσία αυξητικών παραγόντων, η αποσιώπηση του Lacuna προάγει σημαντικά τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων σε μετα-μιτωτικούς νευρώνες (δείκτης β-III τουμπουλίνης και δείκτης NeuN) και σε αστροκύτταρα (δείκτης GFAP), ενώ ο πληθυσμός των προγονικών κυττάρων που είναι Olig2 + και ο πληθυσμός των βλαστικών κυττάρων που είναι νεστίνη+ μειώνονται. Σε αυτές τις συνθήκες, όπου τα νευρικά βλαστικά κύτταρα έχουν καλλιεργηθεί απουσία αυξητικών παραγόντων, ο μεταγραφικός παράγοντας Tbr2 / Eomes δεν εκφράζεται, καθώς τα περισσότερα από τα κύτταρα έχουν ήδη επιλέξει κυτταρική μοίρα ή απλούστερα, έχουν ξεκινήσει τη διαφοροποίησή τους, υποδηλώνοντας ότι το Lacuna έχει μια δράση in trans που αναστέλλει τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων.
Ένα άλλο lncRNA που προσέλκυσε την προσοχή μας είναι το Lockd, ένα lncRNA που έχει ήδη μελετηθεί σε μια κυτταρική σειρά ερυθροκυττάρων. Το Lockd είναι ένα lncRNA αποτελούμενο από 434 νουκλεοτίδια και βρίσκεται περίπου 4 kb μακριά από το γονίδιο Cdkn1b. Το γονίδιο Cdkn1b κωδικοποιεί για το p27, έναν καλά μελετημένο κυκλίνο – εξαρτώμενο αναστολέα κινάσης. Το p27 έχει μελετηθεί εκτενώς στο νευρικό σύστημα και έχει καθιερωθεί ως σημαντικός παράγοντας στην προώθηση της εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο, στη νευρωνική διαφοροποίηση και στη μετανάστευση των νευρικών κυττάρων. Είναι πολύ ενδιαφέρον ότι τόσο το Lockd όσο και το p27 εκφράζονται διαφορικά κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου του μυός, αλλά τα προφίλ έκφρασής τους είναι ουσιαστικά αντίθετα. Λόγω της εγγύτητας των γενετικών τόπων του Lockd και του p27 και λόγω της συμμετοχής του p27 στη διαδικασία για την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο, αρχικά χρησιμοποιήσαμε N2A κύτταρα, μια ταχέως αναπτυσσόμενη κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος μυός για να μελετήσουμε το Lockd και την πιθανή του σχέση με το p27.
Πράγματι, κατά την υπερέκφραση του lncRNA Lockd στην κυτταρική σειρά Ν2Α, ο πολλαπλασιασμός αυξάνεται σημαντικά σε σχέση με τις συνθήκες ελέγχου. Επιπλέον, υπό τις ίδιες συνθήκες, η έκφραση του p27 καταστέλλεται σημαντικά, προτείνοντας ότι το Lockd καταστέλλει την έκφραση του p27, το οποίο με τη σειρά του οδηγεί σε αυξημένο πολλαπλασιασμό, καθώς το p27 προάγει φυσιολογικά την έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο. Καθώς ο πολλαπλασιασμός είναι μια εξαιρετικά κρίσιμη διαδικασία για τα νευρικά βλαστικά κύτταρα κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου, εξετάσαμε επίσης την έκφραση του Lockd σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρικών βλαστικών κυττάρων.
Όντως, το Lockd εκφράζεται σε καλλιέργειες νευρικών βλαστικών κυττάρων, αλλά το πιο ενδιαφέρον στοιχείο είναι ότι η γονιδιακή του έκφραση μειώνεται σημαντικά σε συνθήκες καλλιέργειας χωρίς αυξητικούς παράγοντες σε σύγκριση με την καλλιέργεια παρουσία αυξητικών παραγόντων. Επιπλέον, κατά την υπερέκφραση του Lockd που πραγματοποιήσαμε σε νευρικά βλαστικά κύτταρα, ο πολλαπλασιασμός αυξάνεται και η έκφραση του p27 καταστέλλεται, όπως παρατηρήσαμε στα πειράματα με την κυτταρική σειρά Ν2Α. Αυτά τα πρώτα ευρήματα αποκαλύπτουν μια συναρπαστική σχέση του Lockd με το p27, αλλά και ένα σημαντικό ρόλο αυτού του lncRNA στον πολλαπλασιασμό των Ν2Α κυττάρων και των νευρικών βλαστικών κυττάρων.
Εν κατακλείδι, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι τα lncRNAs είναι νέοι βασικοί παράγοντες στη διαφοροποίηση και τον πολλαπλασιασμό κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εγκεφάλου και παρέχουμε τουλάχιστον δύο τέτοια παραδείγματα. Το Lacuna, ένα νέο lncRNA, είναι απαραίτητο για την έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Tbr2 / Eomes και αναστέλλει τη διαφοροποίηση των νευρικών βλαστικών κυττάρων και το Lockd, ένα ήδη μελετημένο lncRNA σε άλλο σύστημα, επηρεάζει αρνητικά την έκφραση του p27 και προάγει τον πολλαπλασιασμό. Η μελέτη μας παρέχει πληροφορίες για τη συμμετοχή των lncRNAs στην οργανογένεση του κεντρικού νευρικού συστήματος και δείχνει ότι τα lncRNAs μαζί με τα γονίδια που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες σχηματίζουν ρυθμιστικά δίκτυα με σημαντικές λειτουργίες στα νευρικά βλαστικά κύτταρα και στην ανάπτυξη του εγκεφάλου.
