Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Ουρανία Τσιτσιλώνη, Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Ευάγγελος Τέρπος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Ανδρέας Σκορίλας, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Ευστάθιος Καστρίτης, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Δημήτριος Στραβοπόδης, Αν. Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Μαργαρίτης Αυγέρης, Αν. Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Παναγιώτης Παπαγιώργης, Αν. Καθηγητής, Ευρωπαϊκό Πανεπιστήμιο Κύπρο
Περίληψη:
Το πολλαπλούν μυέλωμα (ΠΜ) είναι μια αιματολογική κακοήθεια, η οποία χαρακτηρίζεται από συσσώρευση κακοήθων πλασματοκυττάρων στο μυελό των οστών (ΜΟ). Επιπρόσθετα με τις γενετικές ανωμαλίες οι οποίες εμφανίζονται στους κλώνους ΠΜ, τα πλασματοκύτταρα επηρεάζονται και από το μικροπεριβάλλον του καρκίνου. Αρκετές εργαστηριακές μελέτες έχουν καταδείξει υποσχόμενους παράγοντες, που όμως δεν έχουν οδηγήσει σε κλινικό όφελος. Αυτό μπορεί να οφείλεται σε περιορισμούς κατά την ex vivo δοκιμή του φαρμάκου, η οποία πιθανώς να έχει γίνει χωρίς το μικροπεριβάλλον της νόσου, αλλά και την έλλειψη της προσομοίωσης της τρισδιάστατης αρχιτεκτονικής του περιβάλλοντος του ΜΟ. Συνεπώς, ο χαρακτηρισμός της αποτελεσματικότητας των νέων παραγόντων θεραπείας δεν θα πρέπει μόνο να εκτιμά την άμεση επίδρασή τους στα μυελωματικά κύτταρα, αλλά να λαμβάνει υπόψιν και το συνολικό μικροπεριβάλλον της νόσου.
Βασικός σκοπός της διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη του μικροπεριβάλλοντος στο ΠΜ και η διερεύνηση των υποπληθυσμών που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο σε αυτό. Στο πλαίσιο αυτό, αρχικά διερευνήθηκαν τα υπάρχοντα μοντέλα μελέτης στο ΠΜ υπό το πρίσμα της κλινικής αξιοποίησης. Στη συνέχεια, έγινε de novo κατασκευή τρισδιάστατου ex vivo μοντέλου μελέτης με σκοπό τη διερεύνηση της προστατευτικής δράσης του μικροπεριβάλλοντος στα μυελωματικά κύτταρα υπό την επίδραση θεραπευτικών παραγόντων. Τέλος, με ευρεία ανοσοφαινοτύπηση σε δείγματα ΜΟ και περιφερικού αίματος (ΠΑ) ασθενών με ΠΜ, διευρύναμε την αναζήτηση υποπληθυσμών και αναζητήθηκαν συσχετίσεις με τις διαγνωστικές και θεραπευτικές πληροφορίες των ασθενών.
Κατά τη διερεύνηση των δημοσιευμένων ex vivo μοντέλων μελέτης τέθηκαν κριτήρια τα οποία πληρούνταν στο σύνολό τους, ώστε το προτεινόμενο μοντέλο να θεωρείται ότι προσομοιάζει το μικροπεριβάλλον της νόσου, αλλά και να δύναται να αξιοποιηθεί κλινικά. Τελικώς επιλέχθηκαν 15 δημοσιεύσεις οι οποίες πληρούσαν όλα τα κριτήρια και περιλάμβαναν μοντέλα με ικριώματα γέλης, μοντέλα στερεών ικριωμάτων, μοντέλα βιοαντιδραστήρα, μοντέλα μικρορευστότητας (microfluidics) και μοντέλα με χρήση πειραματόζωων. Υπό αυτά τα δεδομένα αποφασίσθηκε η δοκιμή ικριωμάτων γέλης και στερεών ικριωμάτων.
Για την πειραματική κατασκευή του ex vivo μοντέλου αξιοποιήθηκαν οι μυελωματικές κυτταρικές σειρές U266 και H929, ενώ με χρήση μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων μυελικής προέλευσης (ΒΜ-MSCs) από ασθενείς με ΠΜ μοντελοποιήθηκε το μικροπεριβάλλον της νόσου. Οι θεραπευτικοί παράγοντες που επιλέχθηκαν ήταν η δοξορουβικίνη (ανθρακυκλίνη) και η βορτεζομίμπη (αναστολέας πρωτεασώματος). Αρχικά μελετήθηκε η ανάπτυξη των μυελωματικών κυτταρικών, η συγκέντρωση ημίσειας αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού (IC50) από τους παράγοντες και έγινε απομόνωση και καλλιέργεια πρωτογενών ΒΜ-MSCs. Στη συνέχεια αξιολογήθηκαν μέθοδοι μέτρησης βιωσιμότητας των μυελωματικών κυττάρων, δηλαδή η μέθοδος ΜΤΤ, η κυτταρομετρία ροής, η οπτική μέτρηση και ο αλγόριθμος αναγνώρισης εικόνας. Ο αλγόριθμος αναγνώρισης εικόνας αναπτύχθηκε ειδικά για αυτή την εφαρμογή και με τη χρήση του καταμετρώνται τα κύτταρα που έχουν χρωσθεί με κυανούν του τρυπανίου. Συμπερασματικά, διαπιστώθηκε ότι ανάλογα με τις πειραματικές συνθήκες όλες οι μέθοδοι εκτίμησης της βιωσιμότητας των μυελωματικών κυττάρων μπορούν να αξιοποιηθούν κατά περίπτωση.
Στη συνέχεια, επιχειρήθηκε η κατασκευή καλλιεργειών με χρήση υδρογέλης, αλλά λόγω δυσκολίας στη μέτρηση της βιωσιμότητας των συγκαλλιεργειών στα ικριώματα υδρογέλης, συνεχίσαμε την ανάπτυξη του μοντέλου με στερεά ικριώματα γαλακτικού οξέως (PLA). Τα ικριώματα PLA που χρησιμοποιήθηκαν είχαν δομή πλέγματος με μέγεθος πόρου από 60 έως 120 μΜ και τοποθετήθηκαν σε μικροπλάκες 96 φρεατίων. Mε χρήση συνεστιακής μικροσκοπίας και ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης διαπιστώθηκε ότι τα BM-MSCs αναπτύσσονται στα ικριώματα, εκτεινόμενα ανάμεσα στις ίνες του πλέγματος, επομένως μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στο ex vivo μοντέλο. Έχοντας μελετήσει τα επιμέρους στοιχεία, το συνολικό ex vivo μοντέλο που περιλαμβάνει ικριώματα PLA, δοκιμάσθηκε με την κυτταρική σειρά H929 σε συγκαλλιέργεια με BM-MSCs και υπό την επίδραση βορτεζομίμπης, και σε όλους τους τύπους ικριωμάτων διαπιστώθηκε μεγαλύτερη βιωσιμότητα των μυελωματικών κυττάρων συγκριτικά με τη δισδιάστατη μονοκαλλιέργεια.
Επεκτείνοντας τη μελέτη μας πέραν των μεσεγχυματικών κυττάρων, προχωρήσαμε σε ευρεία ανοσοφαινοτύπηση του μικροπεριβάλλοντος χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Εξετάσθηκε διεξοδικά το ανοσολογικό προφίλ 94 ασθενών με ΠΜ, διερευνώντας κυτταρικούς υποπληθυσμούς μεταξύ των οποίων τα Β και Τ λεμφοκύτταρα και τους υποπληθυσμούς τους, τα Tregs, τα ΝΚ κύτταρα, και τα κατασταλτικά κύτταρα μυελικής προέλευσης (MDSCs). Ταυτόχρονα, αξιοποιήθηκε η πληροφορία για την ύπαρξη ελάχιστης υπολειμματικής νόσου (ΕΥΝ), καθότι οι ασθενείς που συμπεριελήφθησαν στη μελέτη είχαν ελεγχθεί με κυτταρομετρία ροής επόμενης γενιάς για την παρουσία ΕΥΝ σύμφωνα με το πρωτόκολλο του EuroFlow. Επίσης, ελέγχθηκαν πιθανοί συσχετισμοί των υποπληθυσμών με τα διάφορα στάδια της νόσου, το κυτταρογενετικό προφίλ και την ανταπόκριση των ασθενών στην εισαγωγική θεραπεία.
Από την αρχική ανάλυση σε δείγματα ΜΟ διαπιστώθηκε ότι η σύσταση του μικροπεριβάλλοντος του ΜΟ δεν εμφανίζει σημαντικές διαφορές στα διάφορα στάδια εξέλιξης του ΠΜ (MGUS, υφέρπον μυέλωμα, ΠΜ, πλασματοκυτταρική λευχαιμία και ΠΜ σε πλήρη ύφεση), ενώ το περιβάλλον του ΜΟ δεν αντικατοπτρίζει το περιβάλλον του ΠΑ σε ζεύγη δειγμάτων ΜΟ-ΠΑ των ίδιων ασθενών. Εξετάζοντας τις προγνωστικές πληροφορίες, βρέθηκε ότι το ανοσολογικό προφίλ διαφέρει στις διάφορες προγνωστικές ομάδες σύμφωνα με το διεθνές σύστημα σταδιοποίησης στο ΠΜ (ISS), αλλά και με το κυτταρογενετικό προφίλ. Στη συνέχεια, διερευνήθηκε η απάντηση στη θεραπευτική αντιμετώπιση και βρέθηκε ότι σχετίζεται με συγκεκριμένη ανοσολογική υπογραφή κατά τη διάγνωση, ενώ αναλύοντας το ανοσολογικό προφίλ του ΜΟ μετά τη θεραπεία, διαπιστώθηκε ότι οι ασθενείς αρνητικοί για την παρουσία ΕΥΝ, έχουν ξεχωριστή ανοσολογική υπογραφή. Τέλος, αναλύοντας το ΠΑ ασθενών κατά την πλήρη ύφεση, βρέθηκε ότι το ποσοστό των παρθένων και των δραστικών/δραστικών-μνήμης CD4+ T λεμφοκυττάρων σχετίζονται με αρνητική ΕΥΝ και επιπλέον, κατασκευάσαμε έναν υπολογιστικό αλγόριθμο, όπου με βάση την έκφραση αυτών των υποπληθυσμών σε ανεξάρτητη ομάδα 20 ασθενών, επιτεύχθηκε η πρόβλεψη της ΕΥΝ με ευαισθησία 86% και ειδικότητα 85%.
Συνολικά, στο πλαίσιο αυτής της διατριβής κατασκευάστηκε ex vivo πλατφόρμα εξατομικευμένης εκτίμησης της ανταπόκρισης στη θεραπεία ασθενών με ΠΜ, η οποία δύναται να χρησιμοποιηθεί για περαιτέρω μελέτες και διερευνήθηκαν οι κυτταρικοί υποπληθυσμοί στο περιβάλλον της νόσου. Δείχθηκε ότι το ανοσολογικό μικροπεριβάλλον στο ΠΜ είναι δυναμικό και αποκτά διακριτά ανοσολογικά προφίλ στα διάφορα στάδια της νόσου όπως και στις διάφορες προγνωστικές ομαδοποιήσεις των ασθενών. Επιπλέον, αναδείχθηκε η ύπαρξη ανοσολογικής υπογραφής προγνωστικής αξίας, σχετιζόμενης με τη θεραπευτική ανταπόκριση και την παρουσία ΕΥΝ. Φαίνεται ότι η εξατομικευμένη ανάλυση του ανοσολογικού προφίλ στο ΠΜ μπορεί να συμβάλλει θετικά στη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής διαδρομής των ασθενών.
