Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Σοφία Τσελένη-Μπαλαφούτα, Ομότιμη Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Δημήτριος Στραβοπόδης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Ευανθία Αναστασιάδου, Ερευνήτρια Γ', ΙΙΒΕΑΑ
Νικόλαος Καβαντζάς, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Γεώργιος Αγρογιάννης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Δημήτριος Κλέτσας, Διευθυντής, ΙΒΕ "Δημόκριτος",
Γεώργιος Παυλόπουλος, Ερευνητής Β', ΕΚΒΕ "Αλέξανδρος Φλέμιγκ"
Περίληψη:
Οι κακοήθειες του θυρεοειδούς αδένα είναι οι πιο συχνές κακοήθειες του ενδοκρινικού συστήματος και αντιπροσωπεύουν το 1-5% όλων των περιπτώσεων καρκίνου παγκοσμίως. Τα θηλώδη καρκινώματα (PTC) είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου του θυρεοειδούς, αντιπροσωπεύοντας περίπου το 80% των περιπτώσεων με, ως επί των πλείστων, καλή πρόγνωση. Ωστόσο, συγκεκριμένοι υπότυποι όπως οι υπότυποι ψηλών κυττάρων (TCV) διαθέτουν επιθετικά χαρακτηριστικά και κακή πρόγνωση. Η βαθιά κατανόηση των μοριακών συσχετίσεων και των γονιδιακών μονοπατιών που υπαγορεύουν τον προγραμματισμό των κυττάρων και επομένως, η τύχη της νόσου και η επιβίωση του ασθενούς είναι ζωτικής σημασίας. Τα αποτελέσματα από μια τέτοια ανάλυση αναμένεται να συμβάλλουν δραματικά στην καλύτερη ταξινόμηση των περιστατικών αλλά και στην ανάδειξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων.
Προς αυτήν την κατεύθυνση, πραγματοποιήσαμε μια πληθυσμιακή μελέτη και αναλύσαμε την κατανομή συγκεκριμένων κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών. Αποκαλύψαμε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ του TCV φαινοτύπου και της παρουσίας κυτταροπλασματικών ενδοπυρηνικών δομών και ιστικών αλλοιώσεων, όπως των ψευδοεγκλείστων και της ίνωσης, αντίστοιχα. Αυτό συσχετίστηκε με απορρύθμιση συγκεκριμένων διαδικασιών όπως η επεξεργασία πρωτεϊνών στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), η ενεργοποίηση του NFKβ, η κυτταρική προσκόλληση και η ρύθμιση του κυτταροσκελετού, κρίσιμων μονοπατιών που εμπλέκονται στην επιθηλιακή σε μεσεγχυματική μετάβαση (EMT), βασικό μηχανισμό για την εξαλλαγή και τη μετανάστευση των κυττάρων (μετάσταση). Οι κυτταροπλασματικές και πυρηνικές αλλοιώσεις μελετήθηκαν μέσω των αλλαγών στην τοπολογία και στη λειτουργία δομικών πρωτεϊνών, όπως μορίων του κυτταροσκελετού. Οι πυρηνικές δομές και η παρουσία αυλακώσεων, εκκολπώσεων και ψευδοεγκλείστων αναλύθηκαν μέσω προηγμένων τεχνικών μικροσκοπίας. Οι συνιστώσες του συμπλόκου RNA επαγόμενης αποσιώπησης (RISC) όπως οι Drosha, DGCR8, Dicer και Argonaute (AGO), εντοπίζονταν σε αυτές τις δομές, με διάχυτα ή ειδικά εντοπισμένα μοτίβα. Αξιοσημείωτα, οι AGOs, και ειδικότερα ο AGO2, ακολουθούν τις δομές ψευδοεγκλείστων και παρουσιάζουν έντονο σήμα μέσα και κατά μήκος των δομών αυτών. Οι AGOs «φορτώνουν» miRNAs και τα κατευθύνουν στους mRNA-στόχους για μετα-μεταγραφική γονιδιακή ρύθμιση. Η παρουσία του AGO2, του βασικού μέλους της οικογένειας AGO, πιθανότατα αντικατοπτρίζει τη μεγάλη τοπική κυτταρική ανάγκη για αυστηρή γονιδιακή ρύθμιση και αποκατάσταση της τοπικής ομοιόστασης. Το γεγονός αυτό δεν προκαλεί έκπληξη, καθώς η τοπική σύνθεση πρωτεϊνών σε απόκριση σε συγκεκριμένα μοριακά σήματα υπαγορεύει τη μορφολογία, τη λειτουργία και την κυτταρική μοίρα και ως εκ τούτου, την έκβαση της νόσου. Συμπερασματικά, προτείνουμε ότι ο AGO2 δημιουργεί φωλεές, τα «AGO2 locasomes», για αποκατάσταση της τοπικής ομοιόστασης. Άλλωστε, είναι γνωστό ότι ο AGO2 κατανέμεται σε δομές όπως GW- και P-σωμάτια (bodies), σε κυτταρικούς συνδέσμους καθώς και στο μεσόσωμα (midbody), εξυπηρετώντας τις τοπικές ανάγκες μέσω μετα-μεταγραφικής γονιδιακής ρύθμισης. Χρησιμοποιώντας τεχνικές ανοσοφθορισμού, ανάλυσης εικόνας, βιοπληροφορικής και κυτταρογενετικής, αποδείξαμε ότι ο AGO2 εντοπίζεται, επιπροσθέτως στις αποφυάδες της μεμβράνης, όπως σωλήνες ανοιχτού και κλειστού τύπου. Οι ανοιχτού τύποι είναι πιθανότατα κανάλια διακυτταρικής επικοινωνίας ενώ οι κλειστού τύπου είναι κυτοκινητικές γέφυρες. Στις προαναφερθείσες, ο AGO2 συγκεντρώνεται στους βραχίονες μαζί με κυτταροσκελετικές συνιστώσες όπως α-Τουμπουλίνη, Aurora B και διάφορες κινάσες. Ο AGO2, φωσφορυλιωμένος στη σερίνη 387, συνεντοπίζεται με τον Dicer στον δακτύλιο του μεσoσώματος κατά τρόπο που εξαρτάται από τη δραστηριότητα της p38 ΜΑΡΚ. Επιπρόσθετα, καταδείχθηκε η ευαισθησία του ΑGO2 στο στρες και η σημαντικότητά του για την εξασφάλιση του σωστού διαχωρισμού χρωμοσωμάτων και της κυτοκινητικής πιστότητας. Προτείνουμε ότι ο AGO2 είναι μέρος ενός ρυθμιστικού μηχανισμού που ενεργοποιείται από το κυτοκινητικό στρες για τη δημιουργία του κατάλληλου μικροπεριβάλλοντος για τοπική ομοιόσταση. Συμπερασματικά, ο AGO2 φαίνεται να συσσωρεύεται σε συγκεκριμένες κυτταρικές δομές όπως τα ψευδοέγκλειστα και οι κυτταρικές αποφυάδες μαζί με άλλες συνιστώσες του RISC, εξυπηρετώντας πιθανότατα την AGO2-ειδική εντόπιση για την αποκατάσταση της τοπικής μετα-μεταγραφικής ομοιόστασης.
Για την κατανόηση των εμπλεκόμενων μηχανισμών, προσπαθήσαμε να προσδιορίσουμε τα κωδικά και μη-κωδικά γονίδια (όπως τα miRNAs) που εκφράζονται σε φυσιολογικά και κακοήθη υποστρώματα θυρεοειδούς. Χρησιμοποιήσαμε τη μεθοδολογία High-Sequencing of RNAs απομονωμένη με Cross-Linking Immuno-Precipitation (HITS-CLIP) για να καταγράψουμε το τριμερές σύμπλεγμα AGO2::miRNA::mRNA και να αναγνωρίσουμε το "ενεργό" miRNome, δηλαδή το σύνολο των miRNAs που συνδέονται με το RISC και τα mRNA-στόχους. Η βιοπληροφορική ανάλυση αποκάλυψε μια ομάδα 31 απορυθμισμένων miRNAs, με υψηλή στατιστική σημαντικότητα, μεταξύ φυσιολογικής και καρκινικής κυτταρικής σειράς. Συγκριτική ανάλυση με βάση την διαφορική τους έκφραση, αλλά και τα γονίδια-στόχους των miRNAs, ανέδειξε εμπλεκόμενα μοριακά μονοπάτια όπως το μονοπάτι ρύθμισης του κυτταροσκελετού της ακτίνης, μεταγραφικής δυσλειτουργίας στον καρκίνο, σηματοδότησης του ΝFK-β και το μονοπάτι των miRNAs στον καρκίνο που συνηγορεί στην EMT μετάβαση.
Ακολούθως, επικεντρωθήκαμε σε συγκεκριμένα miRNAs, όπως το miR26. Το miR26 ήταν ένας πολλά υποσχόμενος στόχος, καθώς (i) παρουσιάζει την ίδια μεταγραφική συμπεριφορά σε διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές, (ii) μειορρυθμίζεται τόσο σε καρκινικές κυτταρικές σειρές όσο και σε δείγματα ασθενών, (iii) όλα τα μέλη της οικογένειας παρουσιάζουν αντίστοιχο προφίλ έκφρασης και (iv) τα αποτελέσματά μας είναι σε συμφωνία με την βιβλιογραφία. Σε δοκιμασίες in vitro, χρησιμοποιώντας κυτταροκαλλιέργειες, υπερέκφραση του miR26 οδηγεί σε περιορισμό του ογκογόνου δυναμικού καθώς η έκφρασή του έχει αντίστροφη συσχέτιση με την ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Σε ξενομοσχεύματα ποντικιών, που δημιουργήθηκαν με κύτταρα FTC133 επιμολυσμένα με μιμητικές αλληλουχίες miR26, παρατηρήθηκε επιβράδυνση της ανάπτυξης των όγκων και περιφερική αλλά όχι κεντρική -όπως αναμενόταν- νέκρωση στην καρκινική μάζα. Ανάλυση διαφορικής έκφρασης RNA-seq μεταξύ κυττάρων με mimic miR26 και αλληλουχίες scrambled, αποκάλυψε 1.201 στατιστικά σημαντικά απορυθμισμένα γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο, την απόπτωση, την κυτταρική διαίρεση, την κυτταρική προσκόλληση και τη εσφαλμένη μεταγραφική ρύθμιση στον καρκίνο. 133 επιβεβαιώνονται πειραματικά ως άμεσοι στόχοι του miR26. Τα 100 γονίδια με κορυφαία έκφραση χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση μονοπατιών με τον αλγόριθμο PathWalks και ανάδειξαν θεμελιώδη μονοπάτια όπως ο κυτταρικός κύκλος, τα miRNAs στον καρκίνο και η κυτταρική γήρανση. Τέλος, συγκριτική πληροφορική ανάλυση δεδομένων HITS-CLIP και RNA-seq αποκάλυψε 50 απορρυθμισμένα μόρια συμπεριλαμβανομένων των PAWR και STRADB. Tα μόρια αυτά συσχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την κυτταρική μοίρα, κρίσιμες συνθήκες για την EMT μετάβαση. Συμπερασματικά, το miR26, και οι άμεσοι στόχοι του, αποτελούν σημαντικά μόρια για την ογκογένεση και πολλά υποσχόμενους παράγοντες για διάγνωση και θεραπεία κακοηθειών καταστάσεων του θυρεοειδούς αδένα.
Λέξεις-κλειδιά:
Θυρεοειδικό καρκίνωμα, EMT, Πληθυσμιακή μελέτη, Μικρο-σταδιοποίηση, Ψευδοέγκλειστα, AGOs, Σύμπλοκο RISC, MiR26, Mιμητικές μλληλουχίες MiR26, HITS-CLIP
