Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ιωάννης Τρουγκάκος, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ (Επιβλέπων)
Βασιλική Οικονομίδου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Τιμοκράτης Καραμήτρος, Εντεταλμένος Ερευνητής, Μονάδα Βιοπληροφορικής και Εφαρμοσμένης Γενωμικής, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Περίληψη:
Ο SARS-CoV-2 είναι ένας νέος βήτα κορωνοϊός, ο οποίος εμφανίστηκε στο
τέλος του 2019, στην επαρχία Hubei της Κίνας. Προκαλεί τη νόσο coronavirus
disease 2019 (COVID-19), η οποία ανακηρύχθηκε ως πανδημία από τον
Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (ΠΟΥ) στις 11 Μαρτίου του 2020. H κλινική
εικόνα της νόσου COVID-19 εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την ανοσολογική
απόκριση. Στην ανοσολογική απόκριση στη COVID-19 συμμετέχει τόσο η μη
ειδική ανοσία, όσο και η ειδική ανοσία - χυμική και κυτταρική-. Έπειτα από την
είσοδο του SARS-Cov-2 στα ανθρώπινα κύτταρα, ιογενή RNAs
απελευθερώνονται και δρουν σαν ειδικά μοριακά πρότυπα των παθογόνων
(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), τα οποία αναγνωρίζονται
από υποδοχείς αναγνώρισης προτύπων (Pattern recognition receptors,
PRRs), όπως ανάλογοι των Toll υποδοχείς (Toll-like receptors, TLRs). Σαν
αποτέλεσμα, μεταξύ άλλων, εκφράζονται προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες,
χημειοκίνες (πχ, IL-1, IL-6) και διαλυτοί παράγοντες που συσχετίζονται με
γονίδια που κωδικοποιούν ιντερφερόνες (Interferon-Stimulated Genes, ISGs).
Ακόμη, μέρη του ιού, όπως η πρωτεΐνη-ακίδα, μπορούν να αναγνωριστούν
από τα Β λεμφοκύτταρα και να παρουσιαστούν από MHC συμπλέγματα στα Τ
λεμφοκύτταρα, με επακόλουθο την παραγωγή αντισωμάτων και την
κυτταρολυτική δραστηριότητα κατά την οξεία φάση της λοίμωξης. Η
αλληλούχιση του RNA (RNA-SEQ) και η εξειδικευμένη βιοπληροφορική
ανάλυση του μεταγραφώματος ασθενών με COVID19 αποτελεί βασικό
εργαλείο μελέτης της διαφορικής έκφρασης των γονιδίων μεταξύ ομάδων
ασθενών. Η γενική ροή εργασίας κατά την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης
αποτελείται από το πειραματικό μέρος και το υπολογιστικό μέρος. Το
πειραματικό μέρος συνίσταται από τα ακόλουθα βήματα: απομόνωση RNA,
προετοιμασία βιβλιοθήκης, έλεγχος ποιότητας και αλληλούχιση επόμενης
γενιάς, ενώ η βιοπληροφορική ανάλυση συνίσταται από τα εξής βήματα:
επεξεργασία των αναγνώσεων (συμπεριλαμβανομένης της στοίχισης,
alignment), εκτίμηση των επιμέρους επιπέδων γονιδιακής έκφρασης,
κανονικοποίηση, ταυτοποίηση γονιδίων με ανάλυση διαφορικής έκφρασης. Το
QuantSeq αποτελεί μία μέθοδο προετοιμασίας δείγματος RNA με σκοπό τον ακριβή προσδιορισμό της γονιδιακής έκφρασης. Το QuantSeq παρέχει ένα
ευέλικτο πρωτόκολλο για τη δημιουργία βιβλιοθηκών αλληλούχισης επόμενης
γενιάς με υψηλή εξειδίκευση στην αλυσίδα κοντά στο 3′ άκρο
πολυαδενυλιωμένων RNA. Παράγεται μόνο ένα θραύσμα ανά μεταγραφή,
συνδέοντας άμεσα τον αριθμό των αναγνώσεων που αντιστοιχούν σε ένα
γονίδιο με την έκφρασή του.
Στη συγκεκριμένη εργασία, εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο QuantSeq
για τη μελέτη της ανοσολογικής απόκρισης 8 ασθενών με COVID-19, οι οποίοι
διέφεραν ως προς το χρόνο αρνητικοποίησης του RT-PCR SARS-CoV-2 test.
Ειδικότερα, έγινε ανάλυση διαφορικής έκφρασης μεταξύ 4 ασθενών με νόσο
COVID-19, οι οποίοι είχαν θετικό RT-PCR SARS-CoV-2 test τουλάχιστον ένα
μήνα μετά την αρχική θετικοποίηση, και 4 ασθενών που είχαν αρνητικό
δεύτερο test μία εβδομάδα μετά την αρχική θετικοποίηση. Για το σκοπό αυτό,
μετά την εκτέλεση του πειράματος αλληλούχισης QuantSeq,
πραγματοποιήθηκε η βιοπληροφορική ανάλυση με τη χρήση διαφόρων
εργαλείων για το κάθε βήμα, το BBduk για το trimming, το STAR και το
Salmon για τη στοίχιση, το DESeq2 και το edgeR για την ανάλυση διαφορικής
έκφρασης, το DAVID και το g: Profiler για τη λειτουργική ανάλυση και τα
CIBERSORTx και xCell για την ψηφιακή κυτταρομετρία ροής. Η
βιοπληροφορική ροή που επιλέχθηκε ήταν η κάτωθι: STAR ⇛ DESeq2 ⇛
DAVID. Από την ανάλυση διαφορικής έκφρασης βρέθηκαν 4464 διαφορικά
εκφρασμένα γονίδια σε επίπεδο σημαντικότητας 5% και |log2foldchange|>1.
Επίσης, από τη λειτουργική ανάλυση, προέκυψε ότι οι γονιδιακές οντολογίες
που εμπλουτίστηκαν στατιστικά σημαντικά ήταν οι εξής: κυτταρική
προσκόλληση (cell adhesion), χημική συναπτική μετάδοση (chemical synaptic
transmission), σηματοδότηση μεσολαβούμενη από ιντερφερόνη γάμμα
(interferon-gamma-mediated) και τα κάτωθι μονοπάτια: μονοπάτι
σηματοδότησης ασβεστίου (calcium signaling pathway), εθισμός στη μορφίνη
(morphine addiction), καθοδήγηση του άξονα των νευρικών κυττάρων (axon
guidance), μόρια κυτταρικής προσκόλλησης (cell adhesion molecules, CAMs),
διαφοροποίηση οστεοκλαστών (osteoclast differentiation).
