Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Ελένη Σκαλτσά (Επιβλέπουσα), Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
Όλγα Τζάκου, Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
Αναστασία Καριώτη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΑΠΘ
Δέσποινα Περρέα, Ομότιμη Καθηγήτρια, Παθοβιοχημείας, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Διαμάντω Λάζαρη, Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΑΠΘ
Νεκτάριος Αληγιάννης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
Μιχαήλ Ράλλης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Εισαγωγή & Σκοπός
Η ερευνητική κοινότητα, ιδιαίτερα τα τελευταία χρόνια, μελετά με ενδιαφέρον φυτά και φυσικά προϊόντα ως βάση για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη νέων φαρμακευτικών σκευασμάτων για την αντιμετώπιση διαφόρων ασθενειών και κυρίως του καρκίνου και των καρδιαγγειακών παθήσεων που αποτελούν τις δύο κυριότερες αιτίες θανάτου παγκοσμίως. Προσπαθώντας να αναδείξουμε τη μεγάλη σημασία των φυτών της χώρας μας με ευεργετικές ιδιότητες και υψηλής εθνοφαρμακολογικής σημασίας, προέκυψε η παρούσα διδακτορική διατριβή, που αφορά: (α) την απομόνωση και ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών των εκχυλισμάτων του Asplenium ceterach L. (κν. σκορπίδι), καθώς και τη διερεύνηση του τρόπου με τον οποίο επιδρά το παραδοσιακό αφέψημα του A. ceterach σε πειραματικό μοντέλο αθηρωμάτωσης σε μύες με σκοπό την ανάδειξη τυχόν ευεργετικών ιδιοτήτων για το καρδιαγγειακό σύστημα & (β) τη βιοκατευθυνόμενη απομόνωση και ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών του Sideritis euboea Heldr. (τσάι του βουνού) ως προς την κυτταροτοξική τους δράση, καθώς και για την πιθανή ανασταλτική τους δράση έναντι της υαλουρονιδάσης.
Μέθοδοι
• A. ceterach L.
Η δρόγη εκχυλίστηκε διαδοχικά με κυκλοεξάνιο, διχλωρομεθάνιο και μεθανόλη. Μέρος του μεθανολικού εκχυλίσματος υποβλήθηκε στη μέθοδο Charaux-Paris κατά την οποία παραλήφθηκαν υπόλειμμα οξικού αιθυλεστέρα, υπόλειμμα βουτανόλης και υδατικό υπόλειμμα. Μικρή ποσότητα από το κυκλοεξανικό εκχύλισμα της δρόγης υποβλήθηκε σε αέριο υγρο-χρωματογραφία συζευγμένη με φασματογράφο μάζης (GC-MS), καθώς επίσης και σε φασματοσκοπική εξέταση (1H-NMR). Επιπρόσθετα, μελετήθηκε το αρχικό μεθανολικό εκχύλισμα, καθώς και τα υπολείμματα οξικού αιθυλεστέρα και βουτανόλης. Η κλασματοποίησή τους για την παραλαβή των δραστικότερων μεταβολιτών έγινε με τη χρήση διαφόρων τεχνικών όπως MPLC (Medium Pressure Liquid Chromatography) VLC (Vacuum Liquid Chromatography), CC (Column Chromatography), TLC (Thin Layer Chromatography), HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Η ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε μέσω πειραμάτων 1D- & 2D- NMR (Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού).
Για τη διερεύνηση του παραδοσιακού αφεψήματος από το σκορπίδι σε πειραματικό μοντέλο αθηρωμάτωσης χρονικής διάρκειας 8 εβδομάδων, επιλέχθηκαν 24 αρσενικοί μύες (Mus musculus) SV129 άγριου τύπου (wild type-wt) και 24 διαγονιδιακοί μύες με αποσιωπημένο το γονίδιο του PPAR-Alpha (PPARa -/-) σε γενετικό υπόβαθρο SV129 που μελετήθηκαν για χρονικό διάστημα 8 εβδομάδων. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες ομάδες: Ομάδα Α (Αθηρωμάτωσης), Β (Αθηρωμάτωσης + Σκορπίδι) και Γ (control1-υγιείς μάρτυρες) με 8 αρσενικούς μύες wt η κάθε μία, καθώς και Ομάδα Δ (Αθηρωμάτωσης), Ε (Αθηρωμάτωσης + Σκορπίδι) και Ζ (control2-υγιείς μάρτυρες) με 8 αρσενικούς PPARa -/- μύες η κάθε ομάδα. H αθηρωμάτωση σε όλες τις ομάδες επετεύχθη με χορήγηση δίαιτας υψηλής περιεκτικότητας σε λιπαρά (45% λίπος) για χρονικό διάστημα 8 εβδομάδων. Το παραδοσιακό αφέψημα από το σκορπίδι χορηγήθηκε στους μύες σε μορφή υδατικού διαλύματος. Στην αρχή της μελέτης, καθώς και έπειτα από 4 εβδομάδες και στο τέλος του πειράματος πραγματοποιήθηκε μέτρηση σωματικού βάρους, μέτρηση γλυκόζης και αιμοληψία. Επίσης, στην αρχή και στο τέλος της πειραματικής μελέτης πραγματοποιήθηκε και υπερηχογραφική εξέταση. Στο τέλος της πειραματικής μελέτης, έγινε ευθανασία των πειραματοζώων και πραγματοποιήθηκε ανάλυση βιοχημικών παραμέτρων, καθώς επίσης η αορτή, η καρδιά, το ήπαρ και οι νεφροί εξετάστηκαν και εκτιμήθηκαν παθολογοανατομικά.
• S. euboea Heldr.
Η δρόγη (προέλευση: καλλιεργημένοι πληθυσμοί) εκχυλίστηκε διαδοχικά με κυκλοεξάνιο, διχλωρομεθάνιο και μεθανόλη. Μέρος του μεθανολικού εκχυλίσματος υποβλήθηκε στη μέθοδο Charaux-Paris κατά την οποία παραλήφθηκαν υπόλειμμα οξικού αιθυλεστέρα, υπόλειμμα βουτανόλης και υδατικό υπόλειμμα. Μελετήθηκε το διχλωρομεθανικό εκχύλισμα, καθώς και τα υπολείμματα οξικού αιθυλεστέρα και βουτανόλης. Η κλασματοποίησή τους για την παραλαβή των δραστικότερων μεταβολιτών έγινε με τη χρήση διαφόρων τεχνικών όπως προαναφέρθηκε. Η ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών πραγματοποιήθηκε μέσω πειραμάτων 1D- & 2D- NMR.
H κυτταροτοξική δράση μελετήθηκε έναντι τριών ανθρώπινων καρκινικών σειρών (DLD1, HeLa, A549) εφαρμόζοντας τη μέθοδο MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide). Το εύρος των συγκεντρώσεων της ουσίας που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 0-100 μΜ για 72 ώρες.
Οι απομονωμένες ουσίες από το υπόλειμμα του οξικού αιθυλεστέρα υποβλήθηκαν σε in silico μελέτη έναντι του ενζύμου υαλουρονιδάσης. Στη συνέχεια, οι ουσίες που έδειξαν ισχυρή και μέτρια πρόσδεση στο συγκεκριμένο ένζυμο στην in silico μελέτη, καθώς και το αρχικό κλάσμα (υπόλειμμα οξικού αιθυλεστέρα) μελετήθηκαν in vitro με σκοπό να αξιολογηθεί η δράση τους έναντι της υαλουρονιδάσης. Η μελέτη της δράσης της υαλουρονιδάσης με φασματοσκοπία UV, έγινε βάσει της μεθόδου των Morgan-Elson. Οι συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν ήταν 300 μg/mL και 500 μg/mL. Για τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεων των ουσιών (που αξιολογήθηκαν in vitro) με το ένζυμο της υαλουρονιδάσης πραγματοποιήθηκε in silico docking.
Αποτελέσματα
• A. ceterach L.
Συνολικά, απομονώθηκαν 14 φυσικά προϊόντα τα οποία ανήκουν στα φλαβονοειδή (ουσίες 1-4) και στα παράγωγα των φαινολικών οξέων και πρόδρομων ενώσεών τους (ουσίες 5-14). Στο κυκλοεξανικό εκχύλισμα της δρόγης εντοπίστηκε η παρουσία αιθυλεστέρα του παλμιτικού οξέος, του λινελαϊκού οξέος και του α-λινολενικού οξέος.
Από τα αποτελέσματα της in vivo μελέτης προκύπτουν τα εξής: (α) το πειραματικό μοντέλο για τη δημιουργία αθηρωμάτωσης είναι αποτελεσματικό καθώς παρατηρήθηκαν και στους δύο τύπους πειραματοζώων μεταβολές στο σωματικό βάρος, στα επίπεδα γλυκόζης αίματος, χοληστερόλης, LDL χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων. και (β) από το σύνολο των υπερηχογραφικών δεδομένων διαπιστώνεται ότι το αφέψημα από το σκορπίδι διατηρεί σταθερή την εικόνα του ζώου σε σχέση με την ομάδα αθηρωμάτωσης, αλλά και την baseline μέτρηση.
• S. euboea Heldr.
Συνολικά, απομονώθηκαν 48 φυσικά προϊόντα τα οποία ανήκουν στις εξής χημικές κατηγορίες: φυτοστερόλες (ουσίες 1-3), τριτερπένιο (ουσία 4), διτερπενοειδή (ουσίες 5-8), ιριδοειδή (ουσίες 9-12), φλαβονοειδή (ουσίες 13-27), λιγνάνια/νεολιγνάνια (ουσίες 28 & 29), φαινυλοαιθανοειδείς γλυκοσίδες (ουσίες 30-37), φαινολικά οξέα (ουσίες 38-46) και παράγωγα λιπαρών οξέων (ουσίες 47 & 48).
Στην in vitro κυτταροτοξική μελέτη, η σιδερόλη σε συγκεντρώσεις 100 και 50 μΜ εμφάνισε την ισχυρότερη ανασταλτική δράση και στις τρεις καρκινικές σειρές. Οι τιμές IC50 ήταν 26.4 ± 3.7 μΜ (DLD1), 44.7 ± 7.2 μΜ (HeLa) και 46.0 ± 4.9 μΜ (A549). Το διτερπενοειδές έδειξε αξιοσημείωτη κυτταροτοξική δράση στην καρκινική σειρά DLD1 σε σύγκριση με τις άλλες δύο καρκινικές σειρές στις οποίες οι τιμές IC50 ήταν σχεδόν διπλάσιες από εκείνη που εμφάνισε στα DLD1 κύτταρα.
Ο απιγενινο-7-Ο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης και τα ακυλιωμένα παράγωγά του παρουσίασαν την ισχυρότερη πρόσδεση με το ένζυμο της υαλουρονιδάσης στην in silico μελέτη. Οι ουσίες απιγενινο 7-O-β-D-γλυκοπυρανοσίδης, απιγενινο 7-O-[4''-O-Ζ-π-κουμαροϋλο]-β-D-γλυκοπυρανοσίδης, απιγενινο 7-O-[6''-O-Ε-π-κουμαροϋλο]-β-D-γλυκοπυρανοσίδης που έδειξαν ισχυρή πρόσδεση στην in silico μελέτη, καθώς επίσης και οι ουσίες 4'-μεθυλο-υπολαετινο 7-O-[6'''-O-ακετυλο-β-D-αλλοπυρανοσυλο]-(1→2)-β-D-γλυκοπυρανοσίδης και 4'-μεθυλο-υπολαετινο 7-O-[6'''-O-ακετυλο-β-D-αλλοπυρανοσυλο]-(1→2)-6''-O-ακετυλο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (μέτρια πρόσδεση in silico) και το αρχικό κλάσμα (υπόλειμμα οξικού αιθυλεστέρα) μελετήθηκαν in vitro έναντι της υαλουρονιδάσης. To υπολειμμα του οξικού αιθελεστέρα στη συγκέντρωση 300 μg/mL έδειξε χαμηλή ανασταλτική ικανότητα (18.55 ± 0.12%), ενώ σε 500 μg/mL, παρουσίασε μέτρια ανασταλτική ικανότητα (35.67 ± 0.15%). Ο απιγενινο-7-Ο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης, εμφάνισε μέτρια ανασταλτική δράση (34.84 ± 0.08%) σε συγκέντρωση 300 μg/mL και ισχυρή ανασταλτική δράση (64.77 ± 0.06%) σε συγκέντρωση 500 μg/mL. Τα απιγενινο 7-O-[4''-O-Ζ-π-κουμαροϋλο]-β-D-γλυκοπυρανοσίδης και απιγενινο 7-O-[6''-O-Ε-π-κουμαροϋλο]-β-D-γλυκοπυρανοσίδης εμφάνισαν χαμηλή δράση σε συγκέντρωση 300 μg/mL (11.77 ± 0.06% και 0.8 ± 0.15%, αντίστοιχα). Όμως, σε συγκέντρωση 500 μg/mL ο απιγενινο 7-O-[4''-O-Ζ-π-κουμαροϋλο]-β-D-γλυκοπυρανοσίδης ανέστειλε τη δράση της υαλουρονιδάσης σε ποσοστό 34.17 ± 0.08%. Μεταξύ των δύο παραγώγων υπολαετίνης που μελετήθηκαν, ο 4'-μεθυλο-υπολαετινο 7-O-[6'''-O-ακετυλο-β-D-αλλοπυρανοσυλο]-(1→2)-β-D-γλυκοπυρανοσίδης παρουσίασε χαμηλή δράση (7.26 ± 0.11%) σε συγκέντρωση 300 μg/mL, ενώ σε συγκέντρωση 500 μg/mL, η δράση του ήταν μέτρια 35.67 ± 0.06%. Αντίθετα, ο 4'-μεθυλο-υπολαετινο 7-O-[6'''-O-ακετυλο-β-D-αλλοπυρανοσυλο]-(1→2)-6''-O-ακετυλο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης έδειξε χαμηλή αναστολή στην ίδια συγκέντρωση (500 μg/mL, 10.96 ± 0.21%).
Συμπεράσματα
Η παρούσα μελέτη αναδεικνύει τη μεγάλη σημασία δύο φυτών της Ελληνικής χλωρίδας (Asplenium ceterach L. & S. euboea Heldr.) με υψηλή εθνοφαρμακολογική σημασία.
Όσον αφορά τη φυτοχημική μελέτη των δύο φυτών, απομονώθηκαν:
14 φυσικά προϊόντα εκ των οποίων τα 10 απομονώνονται για πρώτη φορά στο A. ceterach L. και από αυτά τα 6 αναφέρονται για πρώτη φορά στο γένος Asplenium L.
48 φυσικά προϊόντα εκ των οποίων 33 απομονώνονται για πρώτη φορά στο S. euboea Heldr και 10 απομονώνονται για πρώτη φορά στο γένος Sideritis L.
Συνεπώς, η συγκεκριμένη μελέτη συμβάλλει σημαντικά και στη χημειοταξινομία των γένων Asplenium L. και Sideritis L.
Δεδομένου ότι το φυτικό υλικό του S. euboea προήλθε από καλλιεργημένους πληθυσμούς, αξίζει να σημειωθεί ότι τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης δείχνουν ότι η καλλιέργεια του συγκεκριμένου είδους είναι εφικτή παρέχοντας ένα πλούσιο φυτοχημικό προφίλ.
Όσον αφορά την in vivo μελέτη του αφεψήματος του A. ceterach, η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη διερεύνηση του παραδοσιακού αφεψήματος από το σκορπίδι σε μοντέλο αθηρωμάτωσης (μύες), εξετάζοντας έναν πιθανό μηχανισμό δράσης του στο μεταβολισμό των λιπιδίων, της γλυκόζης και τον έλεγχο της φλεγμονής μέσω των PPARa υποδοχέων. Συνεπώς, η αρχική υπόθεση ότι το σκορπίδι μπορεί να εμπλέκεται στην εξέλιξη της νόσου φαίνεται να επιβεβαιώνεται από όλα τα δεδομένα της μελέτης. Συγκεκριμένα, προκύπτουν ενδείξεις ότι το παραδοσιακό αφέψημα από το σκορπίδι εμφανίζει προστατευτικό ρόλο στην εξέλιξη της νόσου καθώς φαίνεται ότι σταθεροποιεί ή επιβραδύνει την εξέλιξή της. Ωστόσο περισσότερες μελέτες χρειάζονται να πραγματοποιηθούν για να αποσαφηνίσουν τον μηχανισμό δράσης, τη δοσολογία και τις πιθανές ανεπιθύμητες ενέργειες. Αξίζει να σημειωθεί ότι η συγκεκριμένη μελέτη επιβεβαιώνει τη χρήση του συγκεκριμένου φυτού ως αντιφλεγμονώδη και διουρητικό παράγοντα στη λαϊκή θεραπευτική.
Όσον αφορά τα in vitro πειράματα για το S. euboea, η συγκεκριμένη μελέτη αποτελεί την πρώτη αναφορά για την κυτταροτοξική δράση της σιδερόλης η οποία αποτελεί μία από τις κύριες ουσίες του γένους Sideritis L., αναδεικνύοντας την ως σημαντικό κυτταροτοξικό παράγοντα. Επιπρόσθετα, οι in silico και in vitro μελέτες για την ανασταλτική δράση έναντι της υαλουρονιδάσης του εκχυλίσματος και των απομονωμένων φυσικών προϊόντων από το S. euboea αποκάλυψαν την αξιόλογη δράση κυρίως των παραγώγων απιγενίνης. Η μελέτη αυτή αποτελεί την πρώτη αναφορά για την ανασταλτική δράση του τσάι του βουνού στο συγκεκριμένο ένζυμο, αναδεικνύοντας το ως αντιγηραντικό, αντιφλεγμονώδη και αντικαρκινικό παράγοντα. Συνεπώς, τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώνουν τις παραδοσιακές χρήσεις του γένους Σιδηρίτη ως παράγοντα για την αντιμετώπιση φλεγμονών.
