Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Γουργιώτης Δημήτριος, Ομότιμος Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ (Επιβλέπων)
Σκορίλας Ανδρέας, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Κόσσυβα Λυδία, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Τσολιά Μαρία, Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Καραβανάκη Κυριακή, Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Γαρούφη Αναστασία, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Αυγέρης Μαργαρίτης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Η Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία (ΟΛΛ) αποτελεί νεοπλασία του αιμοποιητικού
συστήματος η οποία χαρακτηρίζεται από την πλήρωση του μυελού των οστών από βλάστες, λόγω του υπέρμετρου πολλαπλασιασμού τους και είναι η πιο συχνή μορφή κακοήθειας της παιδικής ηλικίας, σε ποσοστό περίπου 26% του συνόλου, παγκοσμίως.
Με την σταδιακή βελτίωση των θεραπευτικών πρωτοκόλλων ώστε να βασίζονται στους προγνωστικούς παράγοντες κάθε ασθενούς και να προσαρμόζονται ανάλογα με το βαθμό κινδύνου, καθώς και την υποστηρικτική φροντίδα των ασθενών, το ποσοστό ίασης των παιδιών με ΟΛΛ ανέρχεται πλέον στο 85% στις ανεπτυγμένες χώρες. Παρόλα αυτά, τα φαινόμενα ανθεκτικότητας στην χημειοθεραπεία και υποτροπών των ασθενών υψηλού κινδύνου παραμένουν σε υψηλά ποσοστά. Δεδομένου ότι τα GCs συνιστούν βασικό συστατικό του θεραπευτικού πρωτοκόλλου της παιδικής ΟΛΛ, η αντίσταση στα γλυκοκορτικοειδή παραμένει μέχρι σήμερα κύριο εμπόδιο στην αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας κατά της παιδικής ΟΛΛ, τονίζοντας την ανάγκη για βελτίωση των πρωτοκόλλων και εξατομικευμένη θεραπεία. Επομένως, πέραν των προγνωστικών δεικτών που έχουν καθιερωθεί στην κλινική πράξη ,κρίνεται απαραίτητη η μελέτη και η ταυτοποίηση νέων μοριακών δεικτών, ικανών για έγκαιρη διάγνωση και ακριβή πρόγνωση της νόσου, για να επιτευχθεί η καθιέρωση εξατομικευμένων και στοχευμένων θεραπευτικών σχημάτων. Τα τελευταία θα εστιάζουν στην ανάλυση του ιδιαίτερου γονιδιακού προφίλ κάθε ασθενή και θα προσαρμόζονται στις ανάγκες του, ώστε να ελαχιστοποιηθούν τα φαινόμενα χημειοανθεκτικοτητας.
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, λαμβάνοντας υπόψιν τη δυναμική που παρουσιάζουν τα lncRNAs ως μοριακοί δείκτες στη λευχαιμία, πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά η ανάλυση της έκφρασης και η μελέτη της κλινικής αξίας των lncRNAs GAS5, NEAT1 και LincRNA-p21 στην παιδική Οξεία Λεμφοβλαστική λευχαιμία.
Το GAS5 έχει αποτελέσει το αντικείμενο πληθώρας μελετών, οι οποίες απέδειξαν πως συμμετέχει στη ρύθμιση βασικών κυτταρικών λειτουργιών όπως την ρύθμιση της απόπτωσης, την καταστολή του κυτταρικού κύκλου στην G0/G1 φάση καθώς και τη ρύθμιση της μετάφρασης, μέσω τριών μηχανισμών δράσης. Συγκεκριμένα, μπορεί να αλληλεπιδράσει άμεσα με την DBD αλληλουχία του GR, σχηματίζοντας στο 3’-τελικό άκρο του μια δομή φουρκέτας που μιμείται τις GRE αλληλουχίες των γονιδίων-στόχων, στις οποίες προσδένεται η DBD του GR. Παρουσία λοιπόν γλυκοκορτικοειδών, το ενεργοποιημένο σύμπλοκο GC-GR-GAS5 μεταναστεύει στον πυρήνα όπου το GAS5 ανταγωνίζεται τα DNA GREs των γονιδίων στόχων του GR, για πρόσδεση στη DBD του GR, με αποτέλεσμα την καταστολή της έκφρασης σημαντικών γονιδίων που σχετίζονται με την ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης.
Παρόλο που οι μοριακοί μηχανισμοί δράσης του δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως, το GAS5 lncRNA έχει αποδειχθεί πως παίζει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και την εξέλιξη του καρκίνου μέσω ρύθμισης της απόπτωσης, του πολλαπλασιασμού και της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων ενώ αλλαγές στα επίπεδα του GAS5 έχουν βρεθεί σε πληθώρα ειδών καρκίνου. Ωστόσο, παρά τις πρόσφατες έρευνες που σχετίζουν το GAS5 με την απόκριση στη θεραπεία και την επιβίωση των ασθενών σε πολλούς τύπους καρκίνου, η κλινική του αξία ως διαφοροδιαγνωστικός και προγνωστικός δείκτης για τους ασθενείς με παιδική ΟΛΛ , δεν έχει μελετηθεί μέχρι στιγμής.
Το NEAT1 lncRNA είναι απαραίτητο για την ακεραιότητα των paraspeckles του πυρήνα και συμμετέχει μέσω ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης σε αρκετές φυσιολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων της δαφοροποίησης των ανθρώπινων εμβρυΐκών βλαστοκυττάρων της προστασίας από ατροφία ή απώλεια λειτουργίας των νευρώνων καθώς και της απόκρισης σε ιικές λοιμώξεις. Η ειδικότητα της έκφρασης του ΝΕΑΤ1 στους διάφορους τύπους καρκίνου καθώς και η συσχέτιση των επιπέδων του με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά πολλών καρκίνων το καθιστά αξιόλογο υποψήφιο διαγνωστικό και προγνωστικό βιοδείκτη για αρκετούς τύπους καρκίνου.
Το τελευταίο lncRNA που μελετήθηκε ήταν το LincRNA-p21. Aπό τις μελέτες που έχουν γίνει μέχρι στιγμής έχει αποδειχθεί πως το LincRNA-p21 σχετίζεται με βασικές βιολογικές λειτουργίες όπως την επάγωγή της απόπτωσης, την αναστολή του κυτταρικού κύκλου στην G1 φάση καθώς και την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η απορρύθμιση της έκφρασης του lincRNA-p21 σχετίζεται με την ανάπτυξη και την εξέλιξη ανθρώπινων ασθενειών και κυρίως του καρκίνου.
Βασικός στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μοριακών μεθοδολογιών προσδιορισμού των επιπέδων έκφρασης των υπό μελέτη lncRNAs και η ταυτοποίηση νέων μοριακών δεικτών για την διαφοροδιάγνωση της παιδικής ΟΛΛ, και για την ακριβή πρόγνωση της εξέλιξης της νόσου, της επιβίωσης των ασθενών και της ανταπόκρισής τους στην θεραπεία επιλογής.
Η ανάλυση έκφρασης του GAS5, στο σύνολο των δειγμάτων ΜΟ, αποκάλυψε τα στατιστικώς σημαντικά αυξημένα επίπεδα του GAS5 στους ασθενείς με παιδική ΟΛΛ κατά τη διάγνωση σε σύγκριση με τους μάρτυρες της μελέτης (p=0.023, Mann-Whitney U test), τα οποία μειώνονται επίσης σε στατιστικά σημαντικό βαθμό (Wilcoxon Signed Rank test, p<0.001) την 33η μέρα του θεραπευτικού πρωτοκόλλου, στο 64.2% των ασθενών. Η αξιολόγηση της διαφοροδιαγνωστικής αξίας του lncRNA GAS5 στην παιδική ΟΛΛ πραγματοποιήθηκε μέσω κατασκευής καμπύλης ROC και ανάλυσης λογιστικής παλινδρόμησης. Η ικανότητα των επιπέδων έκφρασης του GAS5 στη διάκριση των ασθενών με ΟΛΛ από τους υγιείς, επιβεβαιώθηκε τόσο από την ανάλυση ROC (AUC=0,597; 95% CI: 0,515-0,697; p=0.023) όσο και την μονομεταβλητή ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης (OR: 2.399; 95% CI: 1.253-4.594; p=0,008), ενώ το μοντέλο πολυμεταβλητής ανάλυσης (OR:2,341; 95% CI:1.114-4.920; p=0,025) υπογράμμισε την ανεξάρτητη διαφοροδιαγνωστική αξία των επιπέδων του GAS5 από την ηλικία και το φύλο των ασθενών.
Σε ότι αφορά την προγνωστική αξία του GAS5 στην παιδική ΟΛΛ, από τις καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier αποδεικνύεται πως οι ασθενείς με υπερέκφραση του GAS5 στη φάση διάγνωσης (“GAS5-high”) παρουσίαζουν στατιστικώς σημαντικό μικρότερο διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου (p=0.026) και ολικής επιβίωσης (p=0.024) σε σχέση με εκείνους με χαμηλότερα/μέτρια επίπεδα έκφρασης (“GAS5-low”). Το μοντέλο μονομεταβλητής παλινδρόμησης κατά Cox, επιβεβαίωσε τον αυξημένο κίνδυνο υποτροπής (HR: 2.900; 95% CI: 1.088 – 7.733; p=0.033) και θανάτου (HR: 3.156; 95% CI: 1.095 – 9.095; p=0.033) για τους ασθενείς με αυξημένη έκφραση του GAS5 κατά τη διάγνωση. Επίσης, από την πολυμεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox προκύπτει ότι η δυσμενής προγνωστική αξία των υψηλών επιπέδων έκφρασης του GAS5 κατά τη διάγνωση για την επιβίωση ελευθέρας νόσου (HR: 3.945; 95% CI: 1.159 – 13.43; p=0.028) και την ολική επιβίωση (HR: 4.223; 95% CI: 1.157 – 15.41; p=0.029) των ασθενών με ΟΛΛ είναι ανεξάρτητη της ηλικίας των ασθενών, των WBC στη διάγνωση, της απόκρισης στην πρεδνιζόνη την 8η ημέρα της θεραπείας, του ποσοστού των βλαστών στον ΜΟ κατά την 15η ημέρα και την 33η ημέρα της θεραπείας, της MRD την 15η ημέρα θεραπείας και του βαθμού κινδύνου των ασθενών.
Η ισχυρή και ανεξάρτητη προγνωστική αξία των επιπέδων έκφρασης του GAS5 σε σχέση με τους ήδη καθιερωμένους προγνωστικούς δείκτες, που αποκαλύφθηκε από την πολυμεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox, επιβεβαιώνεται και από την δυνατότητα του GAS5 να βελτιώνει την προβλεπτική ικανότητα των προγνωστικών δεικτών της ΟΛΛ καθώς ο συνδυασμός των επιπέδων έκφρασης του GAS5 στη διάγνωση με αυτούς, οδήγησε σε στατιστικώς σημαντική βελτίωση της κατηγοριοποίησης των ασθενών σε ομάδες κινδύνου και πρόβλεψης της απάντησης στη θεραπεία. Συγκεκριμένα, οι ‘GAS5-high’ ασθενείς στη διάγνωση, εμφάνισαν σημαντικά μειωμένο διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου και ολικής επιβίωσης, ακόμα και αν χαρακτηρίζονταν από ευνοϊκούς δείκτες, όπως από απάντηση μυελού των οστών Μ1 (ποσοστό βλαστών <5%) την 15η ημέρα θεραπείας (p=0.010 για DFS, p=0.020 για OS) ή από αριθμό WBC<20,000 cells/μl στη διάγνωση (p=0.012 για DFS, p=0.013 για OS). Επιπλέον, η έκφραση του GAS5 στη διάγνωση βελτίωσε στατιστικώς σημαντικά και την προγνωστική ικανότητα της MRD15, καθώς οι ασθενείς που υπερκφράζουν το GAS5, εμφανίζουν στατιστικώς σημαντικά χειρότερη DFS (p<0.001) και OS (p=0.001) σε σύγκριση με MRD≥0.1% ”GAS5-low” ασθενείς, οι οποίοι για την ακρίβεια έχουν απόκριση στη θεραπεία παρόμοια με αυτή των ασθενών με MRD<0.1%. Τέλος οι DCA καμπύλες ανέδειξαν την ισχυρή αναβάθμιση της προγνωστικής αξίας των πολυμεταβλητών μοντέλων που συμπεριλαμβάνουν την υπερέκφραση του GAS5 στην διάγνωση, τόσο για την πρόβλεψη του κινδύνου θανάτου όσο και υποτροπής, συγκριτικά με τα ήδη υπάρχοντα μοντέλα που συμπεριλαμβάνουν τους καθιερωμένους κλινικούς δείκτες αλλά όχι τα επίπεδα έκφρασης του GAS5 στην διάγνωση. Από το γεγονός μάλιστα πως το ποσοστό των threshold probabilities των μοντέλων που συμπεριλαμβάνουν την υπερέκφραση του GAS5 είναι μικρότερο του 10%, επισημαίνεται η βελτίωση στην πρόγνωση της ασθένειας καθώς και στην ανάπτυξη της εξατομικευμένη θεραπείας, που θα προκύψει από την αξιολόγηση των επιπέδων του GAS5 στην διάγνωση.
Τέλος, από την αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης του GAS5 στη διάγνωση, με στόχο την πρόβλεψη της επιβίωσης ελευθέρας νόσου και της ολικής επιβίωσης των ασθενών της ομάδας υψηλού κινδύνου, αποδεικνύεται η κακή απόκριση στη θεραπεία των ‘GAS5-high’ ασθενών αυτής της ομάδας. Συγκεκριμένα, από τις καμπύλες επιβίωσης διακρίνεται πως οι ‘GAS5-high’ ασθενείς υψηλού κινδύνου έχουν ισχυρά στατιστικώς σημαντικό μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής (p=0.007, μέσο DFS: 3.6 έτη) και θανάτου (p=0.001, μέση OS: 5.2 έτη) σε σχέση με τους ‘GAS5-low’, με το positive prediction value (PPV) της υπερέκφρασης του GAS5 για επιβίωσης ελευθέρας νόσου≤5 έτη και ολική επιβίωση≤5 έτη των ΟΛΛ ασθενών της ομάδας υψηλού κινδύνου να είναι 62.5% και 50%, αντίστοιχα. Ομοίως, οι ασθενείς υψηλού κινδύνου με υπερέκφραση του GAS5 στη διάγνωση, που υποβλήθηκαν σε HSCT παρουσιάζουν σημαντικά μειωμένο διάστημα ολικής επιβίωσης (p=0.001) σε σχέση με εκείνους με χαμηλότερη έκφραση.
Λαμβάνοντας υπόψιν λοιπόν, το ρόλο του GAS5 ως αναστολέα της μεταγραφικής δράση του υποδοχέα των γλυκοκορτικοειδών, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι κατά το ALL-BFM θεραπευτικό πρωτόκολλο, οι ασθενείς υψηλού/πολύ υψηλού κινδύνου καθώς και οι ασθενείς που έχουν υποβληθεί HSCT, λαμβάνουν κατά τη διάρκεια της θεραπείας σταθεροποίησης έναν ισχυρότερο συνδυασμό φαρμάκων κατά τον οποίο χορηγούνται γλυκοκορτικοείδη, ενώ οι ασθενείς χαμηλού και ενδιαμέσου κινδύνου δεν λαμβάνουν γλυκοκορτικοειδή σε αυτή τη φάση, από τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης έρευνας, διαφαίνεται η συσχέτιση της κακής απόκρισης στη θεραπεία και της μειωμένης επιβίωσης των ασθενών υψηλού κινδύνου με την υπερέκφραση του GAS5.
Αναφορικά με το ΝΕΑΤ1, από την ανάλυση επιβίωσης των ασθενών με ΟΛΛ, αναδείχτηκε η προγνωστική αξία της αυξημένης έκφρασης του ΝΕΑΤ1 στη διάγνωση, η οποία σχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο θανάτου, τόσο από τις καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier (p=0.018), όσο και από τη μονομεταβλητή ανάλυση κατά Cox (HR: 4.068; 95% CI: 1.146-14.434; p=0.030). Η πολυμεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox αποκάλυψε πως η δυσμενής προγνωστική αξία των υψηλών επιπέδων έκφρασης του ΝΕΑΤ1 κατά τη διάγνωση για την την ολική επιβίωση (OS) (HR: 6.699; 95% CI: 1.404 – 31.970; p=0.017) των ασθενών με ΟΛΛ, είναι ανεξάρτητη της ηλικίας των ασθενών, των WBC στη διάγνωση, της απόκρισης στην πρεδνιζόνη την 8η ημέρα της θεραπείας, του ποσοστού των βλαστών στον ΜΟ κατά την 15η ημέρα και την 33η ημέρα της θεραπείας, της MRD την 15η ημέρα θεραπείας (MRD15) και του βαθμού κινδύνου των ασθενών. Ο συνδυασμός των επιπέδων έκφρασης του ΝΕΑΤ1 στη διάγνωση με τους βιοδείκτες της ΟΛΛ, οδήγησε σε στατιστικώς σημαντική βελτίωση της πρόβλεψης της απάντησης στη θεραπεία. Συγκεκριμένα, οι ‘NEAT1-high’ ασθενείς στη διάγνωση, εμφάνισαν στατιστικά σημαντικά μειωμένη ολική επιβίωση (OS) και τάση για μειωμένο διάστημα επιβίωσης ελευθέρας νόσου (DFS) ακόμα και αν χαρακτηρίζονταν από αριθμό WBC<20,000 cells/μl στη διάγνωση (p=0.03 για OS, p=0.071 για DFS) που αποτελεί ευνοϊκό προγνωστικό δείκτη. Επιπλέον, η έκφραση του ΝΕΑΤ1 στη διάγνωση βελτίωσε στατιστικώς σημαντικά και την προγνωστική ικανότητα της MRD15, καθώς οι ασθενείς με MRD≥0.1% που υπερκφράζουν το ΝΕΑΤ1, εμφανίζουν στατιστικώς σημαντικά χειρότερη DFS (p=0.04) και OS (p=0.009) σε σύγκριση με τους MRD≥0.1% ”NEAT1-low” ασθενείς, οι οποίοι για την ακρίβεια έχουν απόκριση στη θεραπεία παρόμοια με αυτή των ασθενών με MRD<0.1%. Τέλος, οι Μ1 (ποσοστό βλαστών <5% την 15η ημέρα θεραπείας) ασθενείς που υπερεκφράζουν το ΝΕΑΤ1 στη διάγνωση, εμφανίζουν μεγαλύτερο κίνδυνο υποτροπής (p=0.015) και θανάτου (p=0.033) σε σχέση με αυτούς της ίδιας ομάδας που το υποεκφράζουν.
Συμπερασματικά, από τα αποτελέσματα αυτή της μελέτης, διαφαίνεται η προγνωστική αξία του ΝΕΑΤ1 στην απόκριση της θεραπείας και την επιβίωση των ασθενών με παιδική ΟΛΛ. Αναλυτικότερα, τα δεδομένα μας, αναδεικνύουν πως όταν το ΝΕΑΤ1 βρίσκεται σε αυξημένα επίπεδα στους λεμφοβλάστες δρα ως miRNA sponge που προσδένεται σε ογκοκατασταλτικά miRNAs και miRNAs που επάγουν την χημειοευαισθησία σε θεραπευτικούς παράγοντες που χορηγούνται κατά το ALL-IC BFM πρωτόκολλο, οδηγώντας ως αποτέλεσμα σε καταστολή της απόπτωσης και επαγωγή του κυτταρικού κύκλο, μέσω αναστολής της δράσης των miRNA στόχων του.
Σε ότι αφορά την ανάλυση της έκφρασης του LincRNA-p21, δεν προέκυψε στατιστικώς σημαντικό αποτέλεσμα που να αναδεικνύει κάποια κλινική αξία αυτού του lncRNA στη διαφοροδιάγνωση κα την πρόγνωση της παιδικής ΟΛΛ.
