Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Emmanuel Mikros, Professor, Department of Pharmacy, University of Athens, (Supervisor)
George Diallinas, Professor, Department of Biology, University of Athens
Panagiotis Marakos, Professor, Department of Pharmacy, University of Athens
Vittorio Limongelli, Professor, Faculty of Biomedical Sciences, Università della Svizzera italiana
Stathis Frilligos, Professor, Department of Medicine, University of Ioannina
Antonios Kolokouris, Professor, Department of Pharmacy, University of Athens
Vasileios Myrianthopoulos, As. Professor, Department of Pharmacy, University of Athens
Περίληψη:
Οι μεταφορείς είναι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που μεσολαβούν στην επιλεκτική μεταφορά διαλυμένων ουσιών μέσω των βιολογικών κυτταρικών μεμβρανών. Η οικογένεια Nucleobase Cation Symporter 1 (NCS1) που συναντάται σε προκαρυωτικούς οργανισμούς, μύκητες και ορισμένα φυτά, είναι ειδική για τις νουκλεοβάσεις. Η οικογένεια NCS1 απουσιάζει στα θηλαστικά και έτσι γίνεται ένας πολλά υποσχόμενος στόχος για αντιμικροβιακά φάρμακα. Επιπροσθέτως, αρκετοί ανθρώπινοι μεταφορείς (π.χ. μεταφορείς νευροδιαβιβαστών σεροτονίνης και ντοπαμίνης) σημαντικοί από βιολογική σκοπιά, έχουν την ίδια αναδίπλωση με τους μεταφορείς NCS1, ανοίγοντας το δρόμο για νέες γνώσεις σχετικά με την ανάπτυξη αντικαταθλιπτικών φαρμάκων και κατανόησης του μηχανισμού δράσης τους. Μια οικογένεια ειδική για νουκλεοβάσεις, διακριτή φυλογενετικά και δομικά, γνωστή ως Nucleobase Ascorbate Transporter (NAT) ή οικογένεια NCS2, υπάρχει σε βακτήρια, μύκητες, φυτά και μετάζωα, αλλά και σε ανώτερα πρωτεύοντα, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπων, όπου ορισμένα ομόλογα είναι ειδικά για L-ασκορβικό οξύ αντί για νουκλεοβάσεις. Ως εκ τούτου, ο δομικός και λειτουργικός χαρακτηρισμός των συστημάτων NCS1 και NAT/NCS2 αναδεικνύεται ως ένα σημαντικό πρώτο βήμα για μια επιτυχημένη διαδικασία σχεδιασμού φαρμάκων. Αν και υπάρχουν πολλά γενετικά, βιοχημικά και ορισμένα δομικά δεδομένα, λιγότερα είναι γνωστά για τον μηχανισμό μεταφοράς και την ειδικότητα τους. Αυτό είναι συνέπεια της δυσκολίας κρυστάλλωσης ή εκτέλεσης cryo-ΕΜ σε πολυτοπικά διαμεμβρανικά συστήματα με πολλαπλές διαμορφώσεις και των εξαιρετικά εκτενών υπολογιστικών προσεγγίσεων που απαιτούνται για τη θεωρητική περιγραφή τους. Ωστόσο, λίγα μέλη αυτών των οικογενειών έχουν κρυσταλλωθεί, υποδεικνύοντας έναν μηχανισμό εναλλασσόμενης πρόσβασης, σύμφωνα με τον οποίο ο μεταφορέας υφίσταται μεγάλες διαμορφωτικές αλλαγές για να αναγνωρίσει, να δεσμεύσει και να απελευθερώσει το υπόστρωμα κατά μήκος της μεμβράνης. Είναι αξιοσημείωτο ότι όλοι οι μεταφορείς NCS1 και NAT/NCS2 λειτουργούν ως συμμεταφορείς H+ ή Na+.
Στην περίπτωση των ΝΑΤ, 14 διαμεμβρανικά τμήματα (TMS) αναδιπλώνονται σε μια ανεστραμμένη επανάληψη 7 ελίκων (7+7). Οι κρυσταλλικές δομές έχουν ληφθεί από δύο μέλη των ΝΑΤ, τον μεταφορέα ουρακίλης UraA του Ε. coli και τον μεταφορέα UapA ουρικού οξέος-ξανθίνης του Α. nidulans, και αποτελούνται από έναν τομέα πυρήνα και έναν τομέα διμερισμού και λειτουργούν ως διμερή. Ο μηχανισμός λειτουργείας τους θεωρείται πως είναι ο λεγόμενος «μηχανισμός ανελκυστήρα». Οι μεταφορείς NCS1, αποτελούνται από 12 TMS αναδιπλωμένα σε μια ανεστραμμένη επανάληψη 5 ελίκων (5+5), ακολουθούμενα από δύο TMS που δεν έχουν άμεσο ρόλο στη μεταφορά του υποστρώματος. Αυτή η αναδίπλωση είναι χαρακτηριστική για όλους τους μεταφορείς της υπεροικογένειας APC, με κύριους κρυσταλλωμένους εκπροσώπους τον μεταφορέα υδαντοΐνης Mhp1, τον μεταφορέα λευκίνης LeuT, τον μεταφορέα ντοπαμίνης DAT και τον μεταφορέα σεροτονίνης SERT. Όλοι οι NCS1 μεταφορείς, λειτουργούν με τον μηχανισμό «rocking-bundle».
Η παρούσα μελέτη αποτελείται από τέσσερα μέρη. Στο πρώτο μέρος αποκαλύπτουμε τον τρόπο δέσμευσης, μετατόπισης και απελευθέρωσης της ουρακίλης και του Η+ από τον εξωκυττάριο χώρο στο κυτταρόπλασμα του μεταφορέα FurE (NCS1), χρησιμοποιώντας νέες προσομοιώσεις Μεταδυναμικής και ορθολογικά σχεδιασμένες μεταλλάξεις. Συγκεκριμένα, τα διαγράμματα της Επιφανείας Ελεύθερης Ενέργειας που προκύπτουν από τη Μεταδυναμική (FES), παρέχουν τη σχετική σειρά μεταφοράς της ουρακίλης και του πρωτονίου, επιτρέποντας επίσης την επιλογή ενδιάμεσων διαμορφώσεων, που σχετίζονται με τον κύκλο μεταφοράς. Η μεταδυναμική με χρήση περιοριστικής χοάνης (Funnel-Metadynamics), επιτρέπει δειγματοληψία αφενός των μονοπατιών που ακολουθεί το υπόστρωμα προκειμένου να συνδεθεί στη θέση πρόσδεσης και αφετέρου των τρόπων σύνδεσης της ουρακίλης και του πρωτονίου, δημιουργώντας ένα ολιστικό μοντέλο των γεγονότων που διέπουν τη μεταφορά υποστρώματος και που υποστηρίζονται από μελέτες μεταλλάξεων. Η εργασία μας όχι μόνο επεκτείνει τις υπάρχουσες γνώσεις σχετικά με τους μεταφορείς με τεταρτοταγή δομή τύπου FurE (LeuT, DAT, SERT, NET), αλλά επιβεβαιώνει για πρώτη φορά για ένα συμμεταφορέα πρωτονίων, τον λεγόμενο «rocking-bundle» μηχανισμό.
Στο δεύτερο μέρος, παρουσιάζουμε τα 3 μοντέλα του μεταφορέα UapA που κατασκευάστηκαν με χρήση Στοχευμένων Μοριακών Δυναμικών (Targeted Molecular Dynamics) και Μοντέλων Ομολογίας (Homology Modeling), σε διαφορετικές διαμορφώσεις, συνθέτοντας μαζί με την κρυσταλλική δομή τη διαμορφωτική αλλαγή που ακολουθείται κατά τον μηχανισμό του ανελκυστήρα. Επιπλέον, εφαρμόζουμε Μεταδυναμική και αναδεικνύουμε σημαντικές πληροφορίες για τις διαμορφώσεις Inward-Open και Occluded, ενώ αποκαλύπτουμε την ασύγχρονη κίνηση των δύο πρωτομερών του διμερούς. Τέλος, περιγράφουμε τη συμβολή βασικών αμινοξέων στον μηχανισμό του ανελκυστήρα και στη μεταφορά του υποστρώματος.
Στο τρίτο μέρος, διερευνούμε τον ρόλο του συντηρημένου μοτίβου NAT του UapA χρησιμοποιώντας μελέτες Επαγόμενης Πρόσδεσης (Induced Fit Docking), μεθόδους υπολογισμού Ελεύθερης Ενέργειας (Free Energy Methods) και ανάλυση μεταλλάξεων. Επιπλέον, προσφέρουμε νέα ευρήματα σχετικά με τον βασικό ρόλο του F528, ενός καταλοίπου εκτός της θέσης δέσμευσης του υποστρώματος, το οποίο φαίνεται να ρυθμίζει την εξειδίκευση του UapA.
Στο τέταρτο μέρος, εξετάζουμε τις σχέσεις δομής-λειτουργίας των βακτηριακών μεταφορέων SmLL9, XanQ και AncXanQ της οικογένειας NAT, χρησιμοποιώντας Μοριακές Δυναμικές (Molecular Dynamics), Μελέτες Επαγώμενης Πρόσδεσης (Induced Fit Docking) και μεταλλαξιγέννεσης (site-directed mutagenesis), δίνοντας σημαντικά αποτελέσματα όσον αφορά την εξειδίκευση των μεταφορέων αυτών για τα υποστρώματα. Υπογραμμίζεται επίσης ο απροσδόκητα σημαντικός ρόλος των αμινοξέων εκτός της θέσης δέσμευσης στην εξειδίκευση, παρεμβαίνοντας στον μηχανισμό ολίσθησης του μεταφορέα.
Λέξεις-κλειδιά:
διαμεμβρανικοί μεταφορείς, διαμεμβρενικές πρωτείνες, μεταφορείς, πουρίνες, νουκλεοβάσεις, μοριακή δυναμική, μελέτες πρόσδεσης, ελεύθερη ενέργεια πρόσδεσης, μεταδυναμική, Ασπέργιλλος, πρωτόνιο, ουρακίλη, ξανθίνη
