Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Φωκιαλάκης Νικόλαος, Eπ. Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
Αληγιάννης Νεκτάριος, Αναπλ. Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
Τερμεντζή Αικατερίνη, Ερευνήτρια, Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο
Declerck Stephan, Καθηγητής, Earth and Life Institute, UCLouvain
Χήνου Ιωάννα, Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
Γκίκας Ευάγγελος, Καθηγητής, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ
Ασημοπούλου Ανδρεάνα, Αναπλ. Καθηγητρια, Τμήμα Χημικών Μηχανικών, ΑΠΘ
Περίληψη:
Τα φαρμακευτικά φυτά αντιπροσωπεύουν μια πλούσια πηγή βιοδραστικών ενώσεων, πρωτογενών και δευτερογενών μεταβολιτών που έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για τις θεραπευτικές τους ιδιότητες. Τα τελευταία χρόνια, υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον τόσο για τα φυτικά εκχυλίσματα όσο και για τις απομονωμένες ενώσεις και το φάσμα των εφαρμογών τους επεκτείνεται όλο και περισσότερο. Τα φυσικά προϊόντα παρουσιάζουν τεράστια δομική και λειτουργική ποικιλομορφία και σήμερα αποτελούν τα ενεργά συστατικά προϊόντων τόσο στον τομέα των φαρμάκων όσο και στον τομέα των καλλυντικών και των συμπληρωμάτων διατροφής.
Η αυξανόμενη ζήτηση προϊόντων φυτικής προέλευσης έχει οδηγήσει στη διερεύνηση σύγχρονων και μεγάλης κλίμακας τεχνικών που αποσκοπούν στην αύξηση της παραγωγής των βιοδραστικών ενώσεων από φαρμακευτικά φυτά. Οι μεταβολίτες παράγονται σε συγκεκριμένες συνθήκες καλλιέργειας και το μεταβολικό προφίλ των φυτών μπορεί να ποικίλλει σημαντικά ανάλογα με τις περιβαλλοντικές συνθήκες και τις καλλιεργητικές τεχνικές, γεγονός που μπορεί να εμποδίζοντας την εμπορική τους εκμετάλλευση. Η συμβίωση φυτού-μικροοργανισμού, όπως ο εμπλουτισμός με μυκορριζικούς μύκητες ή ενδοφυτικά βακτήρια, έχει δείξει ότι μπορεί να προάγει την ανάπτυξη του φυτού και να ενισχύει την παραγωγή μεταβολιτών κάτω από διαφορετικά συστήματα καλλιέργειας.
Μεταξύ των διάφορων οικογενειών φυτών που έχουν καταγραφεί, η οικογένεια Boraginaceae είναι γνωστή από το Παλαιόκαινο και παρουσιάζει μια σημαντική παγκόσμια κατανομή διαφορετικών ειδών στο βόρειο ημισφαίριο, κυρίως στην Ευρώπη και την Ασία. Η οικογένεια αποτελείται από περισσότερα από εκατό διαφορετικά γένη και περισσότερα από 2000 αναγνωρισμένα είδη φυτών μεταξύ των οποίων τα γνωστά Myosotis, Lithospermum, Alkanna και Anchusa spp. Τα διάφορα είδη έχουν μελετηθεί για τις θεραπευτικές τους ιδιότητες που αποδίδονται στην περιεκτικότητά τους σε βιοδραστικές ενώσεις όπως φλαβονοειδή, φαινυλοπροπανοειδή, σαπωνίνες ή ναφθοκινόνες (π.χ. καρδιοτονωτικά, αντιμικροβιακά, αντιπυρετικά ή αντιασματικά). Μεταξύ των πιο διάσημων ενώσεων είναι τα λιπόφιλα παράγωγα ισοεξενυλναφθαζαρίνης, η Αλκαννίνη και η Σικoνίνη, γνωστές ως πηγή κόκκινης χρωστικής, με πληθώρα βιολογικών δράσεων (π.χ. επουλωτική, αντιμικροβιακή, αντιφλεγμονώδης).
17
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αφιερώσαμε την έρευνά μας στο φυτά Anchusa officinalis λόγω της ευρείας εξάπλωσής του στη λεκάνη της Μεσογείου, και ιδιαίτερα στην Ελλάδα, αλλά και των ποικίλων βιοδραστικών ιδιοτήτων που αποδίδονται στα συγκεκριμένα είδη φυτών.
Στα δύο πρώτα κεφάλαια της παρούσας διατριβής, μελετήθηκαν οι συμβιωτικές καλλιέργειες μεταξύ της Anchusa officinalis, γνωστή για τις θεραπευτικές της ιδιότητες, υπο την επίδραση μυκορριζικών μυκήτων, τα οποία ανήκουν στο γένος Rhizophagus, και οι μεταβολές στο μεταβολικό προφίλ των φυτών. Οι μελέτες αυτές διεξήχθησαν σε άκρως ελεγχόμενες συνθήκες καλλιέργειας και τα φυτά αναπτύχθηκαν σε ένα ημιυδροπονικό σύστημα καλλιέργειας για μέγιστη περίοδο 30 ημερών. Στο τέλος των πειραμάτων, τμήματα βλαστών και ριζών των φυτών υποβλήθηκαν σε διαδικασία εκχύλισης για την αξιολόγηση του μεταβολικού προφίλ τους. Αναπτύχθηκε μια μη στοχευμένη μεταβολική UHPLC-HRMS μελέτη σε συνδυασμό με ανάλυση πολλαπλών μεταβλητών δεδομένων (PCA, PLS-DA και Volcano-plots) για τον εντοπισμό των μεταβολιτών οι οποίοι επηρεάζονται περισσότερο από τις συμβιώσεις. Ο τεράστιος όγκος δεδομένων οδήγησε στον σχολιασμό αρκετών πρωτογενών και δευτερογενών μεταβολιτών που επηρεάστηκαν θετικά από τις συμβιώσεις, συγκρίνοντας τα φάσματα MS/MS με δεδομένα βιβλιογραφίας και επιλεγμένες εσωτερικές βιβλιοθήκες. Η παρούσα μελέτη, συνδυάζοντας ένα ημιυδροπονικό σύστημα καλλιέργειας για την ανάπτυξη του φυτού A. officinalis όπως και την αξιολόγηση του μεταβολικού προφίλ υπό την συμβίωση με τα διάφορους μυκορριζικούς μύκητες, αναφέρεται για πρώτη φορά την βιβλιογραφία. Οι παρούσες μελέτες έχουν στόχο να διευρύνουν τις γνώσεις μας σχετικά με την επίδραση των μυκορριζικών μυκήτων στη ρύθμιση του μεταβολισμού των φυτών και στην πιθανή αξιοποίηση τους για την αύξηση της παραγωγής πολύτιμων βιοδραστικών ενώσεων και για την ανακάλυψη νέων πρωτότυπων μορίων.
Στο Κεφάλαιο I, διεξήχθη για πρώτη φορά στην βιβλιογραφία, μια μη στοχευμένη προσέγγιση μεταβολομικής μελέτης, σε συνδυασμό με πολυπαραγοντική ανάλυση δεδομένων, σε δύο ανεξάρτητα πειράματα ανάπτυξης φυτών που συσχετίζουν την A. officinalis και τον μυκορριζικό μύκητα Rhizophagus irregularis MUCL 41833. Τα φυτά, παρουσία μυκόρριζας (M) ή απουσία μυκόρριζας (NM) αναπτύχθηκαν σε ημιυδροπονικό σύστημα καλλιέργειας για διάρκεια 9 και 30 ημερών. Η επίδραση των μυκορριζικών μυκήτων στην παραγωγή πρωτογενών και δευτερογενών μεταβολιτών αξιολογήθηκε σε βλαστούς, ρίζες και φυτικά εκκρίματα M και NM φυτών. Συνολικά, 35 διαφορετικές ενώσεις επηρεάστηκαν θετικά από την συγκαλλιέργεια εκ των οποίων 10 ταυτοποιήθηκαν ως πρωτογενείς και 25 ως
18
δευτερογενείς μεταβολίτες. Τα αποτελέσματά έδειξαν πως συγκεκριμένα βιοσυνθετικά μονοπάτια (π.χ. μονοπάτια φαινυλοπροπανοειδών και μεβαλονικών, βιοσύνθεση οργανικών οξέων και βασικών αμινοξέων) επηρεάζονται από τον αποικισμό των μυκορριζικών μυκήτων, με διαφορά στις 9 ημέρες ανάπτυξης στο ημιυδροπονικό σύστημα καλλιέργειας. Ανάμεσά τους, αρκετές υποσχόμενες δομές ήδη γνωστές για τις βιοδραστικές τους ιδιότητες (π.χ. ροσμαρινικό οξύ, καφεϊκό οξύ, φερουλικό οξύ συριγγικό οξύ), καθώς και τα μεθυλιωμένα παράγωγά τους (π.χ. μεθυλοροσμαρινικό οξύ, μεθυλσιριγγίνη), επηρεάστηκαν σημαντικά την συμβίωση. Επιπλέον, περιγράφηκαν, για πρώτη φορά στην τρέχουσα μελέτη, δύο παράγωγα σαλβιανολικού οξέος Β και ένα νέο παράγωγο ροσμαρινικού οξέος, τα οποία παρουσιάζουν όλα ένα κοινό πρότυπο υποκατάστασης.
Στο Κεφάλαιο ΙΙ, αναπτύχθηκε μια μη στοχευμένη μεταβολομική προσέγγιση, σε συνδυασμό με πολυπαραγοντική ανάλυση δεδομένων, συσχετίζοντας την A. officinalis με τέσσερα διαφορετικά στελέχη μυκορριζικών μυκήτων του ίδιου γένους (Rhizophagus irregularis MUCL 41833, R. intraradices MUCL 49410, R. clarus MUCL 46238 και R. aggregatus MUCL 49408) υπό την υπόθεση ότι διαφορετικά στελέχη μυκορριζικών μυκήτων επηρεάζουν το μεταβολισμό των φυτών με διαφορετικό τρόπο. Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε ημιυδροπονικό σύστημα καλλιέργειας για 9 ημέρες και το μεταβολικό τους προφίλ αξιολογήθηκε στις ρίζες και τους βλαστούς της A. officinalis σε συνδυασμό με τα τέσσερα διαφορετικά στελέχη. Τα δεδομένα της παρούσας μελέτης έδειξαν ισχυρή επιρροή στον πρωτογενή (π.χ. οργανικά οξέα και αμινοξέα) και ειδικά στον δευτερογενή μεταβολισμό (π.χ. παραγώγων φαινυλοπροπανοειδών, γλυκοσίδες τύπου ολεανάνης). Συνολικά, 6 πρωτογενείς και 36 δευτερογενείς μεταβολίτες ταυτοποιήθηκαν, οι οποίοι επηρεάστηκαν σημαντικά από τις διάφορες συγκαλλιέργειες μυκήτων-φυτών. Μάλιστα, παρατηρήθηκε πως το μεγαλύτερο ποσοστό ταυτοποιημένων ενώσεων (39) επηρεάστηκαν θετικά από την συγκαλλιέργεια με τα στελέχη Rhizophagus irregularis MUCL 41833 και R. intraradices MUCL 49410 υποδηλώνοντας ισχυρότερη επίδραση στο μεταβολισμό των φυτών συγκριτικά με την συγκαλλιέργεια με τα στελέχη R. clarus MUCL 46238 και R. aggregatus MUCL 49408. Στην παρούσα μελέτη, περιγράφηκαν συγκεκριμένα μοτίβα υποκατάστασης των μορίων ως αποτέλεσμα της συμβίωσης. Επιπλέον, ταυτοποιήθηκαν τέσσερα νέα μεβαλονικά παράγωγα και μια νέα ακετυλιωμένη γλυκοσυλιωμένη σαπωνίνη καθώς επίσης και ένα νέο ακετυλιωμένο παράγωγο της μεθυλσυριγγίνης. Όλες οι ενώσεις παρουσιάζουν μια κοινή υποκατάσταση στο C-6 της γλυκόζης.
19
Εκτός από τις πολύτιμες φυτικές βιολογικές ιδιότητες που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη καινοτόμων καλλυντικών και φαρμακευτικών σκευασμάτων, αξίζει να αναφερθεί η παρουσία μεταβολιτών τοξικολογικής σημασίας. Μεταξύ αυτών, τα αλκαλοειδή πυρρολιζιδίνης (AΠ) είναι τα πιο ευρέως διαδεδομένα φυσικά μόρια υψηλής τοξικολογικής σημασίας. Η υψηλή τοξικότητά τους έχει πυροδοτήσει την ανάπτυξη διαφορετικών μεθοδολογιών ποσοτικοποίησης AΠ με βάση τις εμπορικά διαθέσιμες ενώσεις. Ωστόσο, ο περιορισμένος αριθμός πιστοποιημένων προτύπων που διατίθενται επί του παρόντος, εμποδίζει την πραγματική ανίχνευση πολλών ΑΠ σε πολλά φαρμακευτικά φυτά εμπορικού ενδιαφέροντος.
Για τον παραπάνω λόγο, στο Κεφάλαιο III, η μελέτη μας επικεντρώθηκε στη μελέτη της τεράστιας δομικής μεταβλητότητας των τοξικών ΑΠ που απαντώνται στη φύση και στην κατανομής τους σε εκχυλίσματα βιομηχανικού ενδιαφέροντος. Επιπλέον, αναπτύχθηκε μια επικυρωμένη μεθοδολογία ποσοτικοποίησης για την αξιολόγηση της συνολικής περιεκτικότητας σε AΠ ως ισοδύναμα ρετρονεκίνης, αποφεύγοντας το στάδιο εμπλουτισμού του κλάσματος με στήλες SPE και την χρήση εμπορικών αναλυτικών προτύπων. Πιο αναλυτικά, στην συγκεκριμένη μελέτη πραγματοποιήθηκε μια συγκριτική ανάλυση UHPLC- TOF/MSe των AΠ σε έντεκα ακατέργαστα εκχυλίσματα που ελήφθησαν από τις οικογένειες Boraginaceae, Fabaceae και Asteraceae, η οποία συνδυάστηκε με μια προσέγγιση ιεραρχικής ομαδοποίησης των εκχυλισμάτων. Συνολικά, 105 ενώσεις σχολιάστηκαν χρησιμοποιώντας μια στρατηγική διαγνωστικού φιλτραρίσματος θραυσμάτων (DFF) και συγκρίνοντας τα δεδομένα MS/MS των μεταβολιτών με της βιβλιογραφίας και των εσωτερικώς βιβλιοθηκών. Τα δεδομένα μας χωρίστηκαν σε τέσσερις κατηγορίες, ως εξής: (1) μονοεστέρες ΠΑ, ανοιχτής αλυσίδας. (2) διεστέρες ΠΑ, ανοικτής αλυσίδας PA; (3) μακροκυκλικά ΠΑ; (4) γλυκοσιλιωμένα παράγωγα ΠΑ. Στην παρούσα μελέτη επισημάνθηκε πως η κατανομή των ΠΑ εξαρτάται από την οικογένεια των φυτών. Επιπλέον, περιγράφθηκαν 18 νέα γλυκοσιλιωμένα παράγωγα ΑΠ με σημαντικά στοιχεία σχετικά με τη θέση του γλυκοσίδη στην δομή του μορίου, το οποίο σπάνια απαντάται στη βιβλιογραφία.
Ο ποσοτικός προσδιορισμός των ΑΠ στα φυτά εκφράστηκε ως ισοδύναμα ρετρονεκίνης, εξασφαλίζοντας υψηλή ευαισθησία (τιμές LLOD και LLOQ 3,46 pg mL-1 και 11,52 pg mL- 1), ακρίβεια (96,96 – 105,19 %) και επαναληψιμότητας (2,81 – 7,60 % RSD). Τα δεδομένα μας έδειξαν συνολική συγκέντρωση ΑΠ που κυμαινόταν από 8,64 ± 0,08 έως 3096,28 ± 273,72 μg RE/g ξηρού βάρους εκχυλίσματος (EDW) στην Alkanna graeca και Crotalaria retusa. Τα ευρήματά μας ανέδειξαν πως η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε είναι μια ακριβής μεθοδολογία ποσοτικοποίησης ΑΠ με βάση τη ρετρονεκίνη, η οποία μπορεί να αξιοποιηθεί επωφελώς για
20
την ανάλυση εκχυλισμάτων βιομηχανικού ενδιαφέροντος. Επιπλέον, η αποτελεσματικότητα της μεθοδολογίας εμπλουτισμού και συμπήκνωσης των δειγμάτων, τα οποία είναι ευρέως διαδεδομένη στη βιβλιογραφία για τα πλεονεκτήματά τους τόσο στη μείωση του φορτίου του περιβάλλοντος του εκχυλίσματος όσο και στη συγκέντρωση ΑΠ από τα ακατέργαστα εκχυλίσματα, φάνηκε να μην είναι αποτελεσματική σε σχέση με την ποσοτικοποίηση των κύριων ΑΠ στα εκχυλίσματα.
Συμπερασματικά, όλες οι προσπάθειες της παρούσας διδακτορικής διατριβής επικεντρώθηκαν στη μελέτη καινοτόμων πρωτόκολλων καλλιέργειας για την ενίσχυση της παραγωγής πρωτογενών και δευτερογενών μεταβολιτών σε φαρμακευτικά φυτά και στην ανάπτυξη μιας μεθοδολογίας μεταβολομικής ανάλυσης σε συνδυασμό με πολυπαραγοντική ανάλυση δεδομένων η οποία μπορεί εύκολα να εφαρμοστεί για την αξιολόγηση της επίδρασης της συμβίωσης μυκορριζικών μυκήτων στην παραγωγή μεταβολιτών από τα φυτά. Επιπλέον, εστιάσαμε στην ανάπτυξη εξαιρετικά ευαίσθητων αναλυτικών μεθόδων για την ταυτοποίηση και τον ποσοτικό προσδιορισμό της συνολικής περιεκτικότητας ΑΠ στα εμπορικά φυτικά εκχυλίσματα αποφεύγοντας οποιοδήποτε πρόσθετο στάδιο εμπλουτισμού και τη χρήση εμπορικών αναλυτικών προτύπων.
