Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Τσιόδρας Σωτήριος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Αντωνιάδου Αναστασία, Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Βρυώνη Γεωργία, Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Παπαδόπουλος Αντώνιος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Πουλάκου Γαρυφαλλιά, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Ψυχογυιού Μήνα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Μαρίνος Γεώργιος, Επίκουρος Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Η μεθυλίωση του 16S ριβοσωμικού RNA (rRNA) έχει αναφερθεί σαν ένας αναδυόμενος μηχανισμός αντοχής στις αμινογλυκοσίδες σε παθογόνα Gram-αρνητικά μικρόβια από το 2003 και αναφέρεται όλο και περισσότερο παγκοσμίως. Δέκα διαφορετικά γονίδια (rmtA, rmtB, rmtC, rmtD, rmtE, rmtF, rmtG, rmtH, armA, npmA) που κωδικοποιούν τα αντίστοιχα ένζυμα έχουν περιγραφεί μέχρι σήμερα, σε κλινικά αλλά και σε κτηνιατρικά στελέχη, και προσδίδουν υψηλού επιπέδου αντοχή σε όλες τις κλινικά χρησιμοποιούμενες αμινογλυκοσίδες. Τα γονίδια αυτά βρίσκονται κυρίως σε τρανσποζόνια πάνω σε συζευκτικά πλασμίδια που τους δίνουν τη δυνατότητα οριζόντιας εξάπλωσης, γεγονός που μπορεί εν μέρει να εξηγήσει την παγκόσμια εξάπλωση αυτού του μηχανισμού σε μικρόβια της οικογένειας των Εντεροβακτηριακών και σε μη ζυμωτικά βακτήρια, συμπεριλαμβανομένων των P. aeruginosa και Acinetobacter spp. Μεγάλη ανησυχία προκαλεί η ανάπτυξη πολυαντοχής των μικροβίων που παράγουν 16S rRNA μεθυλάσες μέσω της συσσώρευσης διαφόρων γονιδίων μικροβιακής αντοχής, καθώς αρκετά από αυτά τα στελέχη έχουν βρεθεί να παράγουν ταυτόχρονα και καρβαπενεμάσες ή ευρέος φάσματος β-λακταμάσες. Μέχρι στιγμής, έχουν αναφερθεί 16S rRNA μεθυλάσες σε τουλάχιστον 30 χώρες ή περιοχές. Η παγκόσμια εξάπλωσή τους εξελίσσεται σε μια σοβαρή απειλή, γεγονός που συνεπάγεται την ανάγκη συνέχισης της έρευνας με απώτερο σκοπό τον περιορισμό της περαιτέρω διάδοσής τους.
Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της ύπαρξης γονιδίων που κωδικοποιούν 16S rRNA μεθυλάσες στα Εντεροβακτηριακά στελέχη αλλά και στα στελέχη P. aeruginosa και Acinetobacter spp. που απομονώνονται από καλλιέργειες ασθενών που νοσηλεύονται σε μεγάλα νοσοκομεία της Αθήνας και ο ακριβής επιπολασμός τους τα έτη 2015 - 2016. Επιπρόσθετος στόχος ήταν η μελέτη του γενετικού υποστρώματός τους και της συνύπαρξής τους με γονίδια αντοχής για άλλες ομάδες αντιμικροβιακών, όπως οι β-λακτάμες (β-λακταμάσες), οι καρβαπενέμες (καρβαπενεμάσες) και οι κινολόνες (qnr, aac(6’)-cr, oqxAB), στα ίδια συζευτικά πλασμίδια.
Η συλλογή και μελέτη των στελεχών έγινε στο Ερευνητικό Εργαστήριο Λοιμώξεων και Αντιμικροβιακής Θεραπείας της Δ’ Παθολογικής Κλινικής του Πανεπιστημίου Αθηνών. Από τα μικροβιολογικά εργαστήρια των συνεργαζόμενων νοσοκομείων συλλέχθηκαν Gram-αρνητικά στελέχη (Εντεροβακτηριακά, P.aeruginosa ή Acinetobacter spp.) που παρουσίαζαν ταυτόχρονα αντοχή στην αμικασίνη και στην γενταμικίνη. Τα στελέχη συγκεντρώθηκαν στο κεντρικό εργαστήριο, όπου έγινε προσδιορισμός των ελάχιστων ανασταλτικών συγκεντρώσεων (MIC) στις αμινογλυκοσίδες αμικασίνη, γενταμικίνη, τομπραμυκίνη και απραμυκίνη. Ακολούθησε μοριακός έλεγχος με PCR για ανίχνευση γονιδίων 16S rRNA μεθυλοτρανσφερασών στα στελέχη που παρουσίαζαν υψηλού επιπέδου αντοχή. Όσον αφορά την αντοχή σε άλλα αντιβιοτικά, προσδιορίστηκε η ευαισθησία των RMT-θετικών στελεχών σε όλες τις κλινικά σημαντικές ομάδες αντιμικροβιακών, ενώ με μοριακό έλεγχο έγινε η διερεύνηση για την ύπαρξη καρβαπενεμασών και για την κλωνικότητα των στελεχών ανά είδος. Στη συνέχεια ελέγχθηκε η πιθανή πλασμιδιακή θέση του γονιδίου rmtB που βρέθηκε στα Εντεροβακτηριακά στελέχη, η δυνατότητα μεταφοράς του, καθώς και η συνύπαρξη στο ίδιο πλασμίδιο άλλων γονιδίων αντοχής. Τέλος έγινε σύγκριση των πλασμιδίων που έφεραν το rmtB και είχαν απομονωθεί από διαφορετικούς γονότυπους Εντεροβακτηριακών στελεχών. Καθώς παρατηρήθηκε ότι όλα τα RMT-θετικά Εντεροβακτηριακά στελέχη παρήγαγαν καρβαπενεμάση, ελέγθηκε επιπλέον και μια πανελλήνια συλλογή κλινικών στελεχών K. pneumoniae που παρήγαγαν καρβαπενεμάση (της ίδιας χρονικής περιόδου) για να μελετηθεί ξεχωριστά ο επιπολασμός των RMTs στην ομάδα αυτή.
Η μεθυλάση ArmA κυριαρχεί μεταξύ των ανθεκτικών στις αμινογλυκοσί-δες κλινικών στελεχών A. baumannii, που κυκλοφορούν στα νοσοκομεία της Αθήνας. Τα στελέχη αυτά παράγουν παράλληλα καρβαπενεμάση, κατά κύριο λόγο ΟΧΑ-23, είναι XDR ή PDR, και ανήκουν στον διεθνή κλώνο IC II. Στα Εντεροβακτηριακά στελέχη παρατηρήθηκε επίσης σαφής συσχέτιση της παραγωγής μεθυλάσης RmtB με γονίδια καρβαπενεμάσης, γεγονός ιδιαίτερα ανησυχητικό, καθώς οι RMTs και οι καρβαπενεμάσες προσδίδουν αντοχή σε πολλές κατηγορίες αντιβιοτικών που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία των λοιμώξεων από Gram-αρνητικά βακτήρια. Όσον αφορά τη συλλογή των στελεχών K. pneumoniae που παρήγαγαν καρβαπενεμάση, το 6.8% των στελεχών βρέθηκε να παράγει και μεθυλάση.
Πολύ υψηλά ποσοστά αντοχής στην κολιστίνη παρατηρήθηκαν τόσο στα στελέχη A. baumannii, όσο και στα στελέχη K.pneumoniae. Η φωσφομυκίνη ήταν ο πιο δραστικός παράγοντας έναντι του συνόλου των Εντεροβακτηριακών, ενώ οι συνδυασμοί κεφταζιδίμης/αβιμπακτάμης και μεροπενέμης/ βαμπορμπακτάμης έδειξαν άριστη δράση έναντι των στελεχών K. pneumoniae που παρήγαγαν KPC ή/και OXA-48 ο πρώτος και KPC ο δεύτερος.
Επιπλέον, αυτή η μελέτη κατέδειξε μια πολλά υποσχόμενη in vitro δράση της απραμυκίνης έναντι των XDR και PDR A. baumannii στελεχών, αλλά και έναντι των πολυανθεκτικών στελεχών K. pneumoniae, που δικαιολογεί περαιτέρω αξιολόγηση της για τη θεραπεία λοιμώξεων από αυτά τα στελέχη, καθώς μπορεί να αποτελέσει βάση για σχεδιασμό παραγώγων με ακόμη καλύτερη δράση και μειωμένη τοξικότητα.
Ο εντοπισμός του rmtB σε συζευκτικό πλασμίδιο, μαζί με τα γονίδια blaVEB, blaOXA-10 και blaTEM, καθώς και ο εντοπισμός των blaVIM και blaSHV στο ίδιο πλασμίδιο σε στελέχη P. mirabilis, P. stuartii, και E. coli, κάνει την κατάσταση ακόμη πιο ανησυχητική και επιβάλει την ανάγκη για παρακολούθηση καθώς και τη λήψη μέτρων για τον περιορισμό της εξάπλωσης του.
Συμπερασματικά, η παραγωγή 16S rRNA μεθυλασών είναι ένας αναδυόμενος μηχανισμός αντοχής, ικανός να θέσει σε κίνδυνο την κλινική αποτελεσματικότητα όλων των αμινογλυκοσιδών, ακόμα και των νεότερων που δεν βρίσκονται ακόμα σε κλινική χρήση.
