Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Εμμανουήλ Φραγκούλης, Ομότιμος Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Ζαφειρούλα Γεωργούση, Ερευνήτρια Α’, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»
Διαμάντης Σίδερης, Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Σπύρος Ευθυμιόπουλος, Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Διδώ Βασιλακοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Ιωάννης Σωτηρόπουλος, Ερευνητής Γ’, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»
Μαρία Γαϊτάνου, Ερευνήτρια Γ’, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Περίληψη:
Οι οπιοειδείς υποδοχείς (OR) σχηματίζουν δυναμικά πολυλειτουργικά σύμπλοκα με μια πληθώρα πρωτεϊνών, εκτός από τις G-πρωτεΐνες, πυροδοτώντας την ενεργοποίηση διαφορετικών κυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών όπως η νευριτική ανάπτυξη, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η κυτταρική διαφοροποίηση. Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στο ρόλο του δ-οπιοειδούς υποδοχέα (δ-OR) στη νευρογένεση, καθώς ο ίδιος εκφράζεται σε περιοχές του εγκεφάλου (φλοιό, αμυγδαλή, ιππόκαμπο) που σχετίζονται με τη σκέψη, τη μνήμη και τα συναισθήματα. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου έχουν δείξει ότι ο δ-OR αποτελεί μια πλατφόρμα αλληλεπίδρασης για διάφορες πρωτεΐνες οι οποίες εμπλέκονται σε κομβικά κυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια. Δύο από αυτές τις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με το καρβοξυτελικό άκρο του δ-OR (δ-CT) σε μία συγκεκριμένη συντηρημένη περιοχή που διαθέτει το YXXL μοτίβο είναι ο μεταγραφικός παράγοντας STAT5B και ο ρυθμιστής των G-πρωτεϊνών 4 (RGS4) (Leontiadis et al. 2009; Georgoussi et al 2006; 2012; Georganta et al. 2010).Οι ρυθμιστές των G-πρωτεϊνών (RGS πρωτεΐνες) έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με τις Gα υπομονάδες και να αυξάνουν το ρυθμό υδρόλυσης του GTP της Gα λόγω της GAP δραστικότητας του, ενώ επιπρόσθετα δεδομένα αποδεικνύουν ότι πολλές RGS πρωτεΐνες εμπλέκονται σε κυτταρικά μονοπάτια, όπως είναι η μεταγραφική ρύθμιση και η νευρογένεση, ανεξάρτητα από την GAP δραστικότητα τους. Προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου Κυτταρικής Σηματοδότησης και Μοριακής Φαρμακολογίας έδειξαν ότι RGS4 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της οπιοειδούς σηματοδότησης, διότι βοηθά τον δ-OR να επιλέξει με ποια G-πρωτεΐνη θα αλληλεπιδράσει, αναστέλλει την από τον δ-OR επαγόμενη ενεργοποίηση των ERK1/2 και μειώνει το ρυθμό εσωτερίκευσης του. Επιπρόσθετα, ο κύριος ιστός έκφρασης της RGS4 είναι ο εγκέφαλος (φλοιός, ιππόκαμπος, θάλαμος) με τη δράση της να έχει συσχετιστεί με παθολογίες του νευρικού συστήματος όπως η σχιζοφρένεια, το άγχος, η εξάρτηση και το Alzheimer.Γνωρίζοντας από προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου ότι ο δ-OR σχηματίζει ένα πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο αποτελούμενο από τις Gi/Go πρωτεΐνες και τον STAT5B μεταγραφικό παράγοντα, το οποίο εμπλέκεται σε αλλαγές της νευριτικής ανάπτυξης μετά από χορήγηση του ειδικού αγωνιστή του δ-OR, DSLET, (Georganta et al. 2010; 2013), καθώς και το γεγονός ότι η RGS4 είναι μία πολυ-λειτουργική πρωτεΐνη που εκφράζεται στον εγκέφαλο και συμμετέχει στην νευρική ανάπτυξη μέσω αδιευκρίνιστων μηχανισμών, στόχος μας ήταν να μελετηθεί ο ρόλος της RGS4 στη νευριτική ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση.Με δεδομένη την αλληλεπίδραση της RGS4 και του STAT5B με τον δ-OR στο ίδιο σημείο του δ-CT, το πρώτο ερώτημα που τέθηκε ήταν να διερευνηθεί εάν τα δύο αυτά μόρια αλληλεπιδρούν μεταξύ τους. Πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης απέδειξαν για πρώτη φορά την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ της RGS4 και του STAT5B μεταγραφικού παράγοντα σε κύτταρα ΗΕΚ293 που εκφράζουν σταθερά τον δ-OR (δ-ΗΕΚ293) αλλά και στο ενδογενές περιβάλλον του εγκεφάλου ποντικών. Επιπρόσθετες μελέτες έδειξαν περαιτέρω ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ της RGS4 και του STAT5B παραμένει ακόμη και μετά την ενεργοποίηση του δ-OR και συμβαίνει ανεξάρτητα από την κατάσταση ενεργοποίησης των G-πρωτεϊνών. Για να προσδιορίσουμε σε ποιο υποκυτταρικό διαμέρισμα πραγματοποιείται η σύζευξη μεταξύ της RGS4 και του STAT5B διαχωρίσαμε κυτταροπλασματικά και πυρηνικά εκχυλίσματα από κύτταρα δ-ΗΕΚ293 που εκφράζουν παροδικά την RGS4 και ενεργοποιήθηκαν με τον δ-αγωνιστή DSLET. Tα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η αλληλεπίδραση αυτή RGS4-STAT5B πραγματοποιείται μόνο στο κυτταρόπλασμα και όχι στον πυρήνα. Σε συμφωνία με τα προηγούμενα δεδομένα, in vitro pulldowns μελέτες επιβεβαίωσαν την άμεση αλληλεπίδραση της RGS4 και του STAT5B με υπεύθυνο σημείο αλληλεπίδρασης τους το τμήμα DNA-binding-SH3 του STAT5B. Σε επόμενο στάδιο μελετήθηκε το βιολογικό αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης μεταξύ της RGS4 και του STAT5B. Οι μελέτες μας έδειξαν ότι η RGS4 μειώνει τη μεταγραφική ενεργότητα του STAT5B μετά την ενεργοποίηση του υποδοχέα της ερυθροποιητίνης (EPO-R) ή του δ-OR. Συγκεκριμένα βρέθηκε ότι σε κύτταρα ΗΕΚ293 όπου εκφράζεται παροδικά ο EPO-R, η RGS4 μπλοκάρει τη φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα STAT5B που επάγεται από την ερυθροποιητίνη. Επιπλέον, εξετάστηκε η επίδραση της RGS4 στη μεταγραφική ενεργότητα του STAT5B υπό την επίδραση οπιοειδών. Κύτταρα δ-ΗΕΚ293 που εκφράζουν ενδογενώς το STAT5B και παροδικά την STAT5A, επωάστηκαν με τον αγωνιστή DSLET, και πειράματα συνανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι η έκφραση της RGS4 παρεμποδίζει τη δημιουργία ετεροδιμερών μεταξύ των STAT5A και STAT5B μεταγραφικών παραγόντων επηρεάζοντας έτσι τη μεταγραφική του ενεργότητα. Στην προσπάθεια μας να μεταφράσουμε τη φυσιολογική σημασία της σύζευξης μεταξύ της RGS4 και του STAT5B και γνωρίζοντας από προηγούμενα βιβλιογραφικά δεδομένα ότι πολλές RGS πρωτεΐνες συμμετέχουν στη νευροπροστασία καθώς και τη συμμετοχή του STAT5B στη νευριτική ανάπτυξη Neuro2A κυττάρων υπό την επίδραση δ-οπιοειδών αναλόγων, μελετήσαμε τον πιθανό ρόλο της RGS4 στη νευριτική ανάπτυξη. Για το σκοπό αυτό κατασκευάστηκε μια νευρική κυτταρική σειρά που εκφράζει σταθερά τον δ-OR (δ-Neuro2A) και μελετήθηκε το ποσοστό της δ-επαγόμενης νευριτικής ανάπτυξης παρουσία της RGS4. Οι μετρήσεις μας έδειξαν ότι παρουσία της RGS4 το ποσοστό της νευριτικής ανάπτυξης μειώνεται σημαντικά συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου Neuro2A παρουσία του DSLET. Το παραπάνω αποτέλεσμα αποτελεί μια πρώτη ένδειξη της συμμετοχής της RGS4 στη νευριτική ανάπτυξη και διαφοροποίηση που επάγεται από τον δ-OR. Τα δεδομένα αυτά επιβεβαιώθηκαν σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων φλοιού εγκεφάλου διαγονιδιακών RGS4-/- μυών, καθώς βρέθηκε ότι οι RGS4-/- νευρώνες παρουσιάζουν εκτενείς νευράξονες και αυξημένο αριθμό νευριτικών διακλαδώσεων συγκριτικά με τους νευρώνες αγρίου τύπου. Επιπλέον, η αύξηση αυτή γίνεται εντονότερη παρουσία του δ-αγωνιστή DSLET. Οι μελέτες μας έδειξαν επίσης ένα νέο ρυθμιστικό ρόλο της δράσης της RGS4 στον πολλαπλασιασμό νευρικών κυττάρων και βλαστοκυττάρων. Η σταθερή κυτταρική σειρά που κατασκευάσαμε και εκφράζει σταθερά την RGS4 (Neuro2A-RGS4), παρουσίασε χαμηλότερα επίπεδα επιβίωσης και πολλαπλασιαστικής ικανότητας συγκριτικά με τα κύτταρα ελέγχου Neuro2A όπως απέδειξαν οι μετρήσεις αποκλεισμού με Trypan Blue και οι μετρήσεις ενσωμάτωσης του αναλόγου BrdU, αντίστοιχα. Η συμμετοχή της RGS4 στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των νευρικών κυττάρων επιβεβαιώθηκε σε ένα in vivo σύστημα, αυτό των RGS4-/- βλαστοκυττάρων. Συγκεκριμένα, στα RGS4-/- νευροβλαστοκύτταρα παρατηρείται αύξηση της γονιδιακής έκφρασης των αντιαποπτωτικών γονιδίων στόχων του STAT5B, Bcl-2 και Bcl-xl, αποδεικνύοντας έτσι τη δράση της RGS4 στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω της μεταγραφικής ρύθμισης. Τέλος, επιπρόσθετες μελέτες έδειξαν ότι η RGS4 πρωτεΐνη εμπλέκεται στη νευρική ομοιόσταση, ρυθμίζοντας την αυτοφαγία σε πρωτογενείς καλλιέργειες νευρώνων του φλοιού εγκεφάλων μυών πιθανώς μέσω δύο οδών που συμμετέχουν οι κινάσες AKT και JNK.Όλα τα αποτελέσματα αυτά δεικνύουν ένα νέο λειτουργικό ρόλο της RGS4 στον έλεγχο της νευρική ανάπτυξης και διαφοροποίησης συμβάλλοντας στην ομοιόσταση των νευρώνων, ανοίγοντας νέες κατευθύνσεις για το ρόλο των RGS πρωτεϊνών στην ανάπτυξη των νευρώνων μετά από τη χορήγηση οπιοειδών ή μη.
