Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Ουρανία Τσιτσιλώνη - Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Παναγιώτα Παπαζαφείρη - Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Παρασκευή Ζησιμοπούλου - Ερευνήτρια Α’, Τμήμα Νευροβιολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Χαράλαμπος Αλεξόπουλος – Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Πέτρος Γκιάστας – Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Ευδοκία Καραγκούνη – Ερευνήτρια Α’, Τμήμα Μικροβιολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Κωνσταντίνος Λαζαρίδης – Ερευνητής Β’, Τμήμα Ανοσολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Περίληψη:
Τα αυτοάνοσα νευρολογικά νοσήματα είναι σπάνια νοσήματα με ετερογένεια στον κλινικό τους φαινότυπο, ενώ συχνά η ακριβής τους διάγνωση έγκειται σε ειδικούς βιοδείκτες. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι ο εντοπισμός αυτοαντισωμάτων, με σκοπό να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για τη διάγνωση αυτών των νοσημάτων. Συγκεκριμένα, στο πρώτο μέρος, γίνεται ανάλυση της ειδικότητας των αυτοαντισωμάτων έναντι του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης (nAChR) σε ορούς από μυασθενείς. Αν και τα αυτοαντισώματα αυτά είναι γνωστοί βιοδείκτες για τη νόσο, η ανίχνευση μόνο παθογόνων αυτοαντισωμάτων θα συμβάλλει στην αποτελεσματικότερη χρήση των αυτοαντισωμάτων ως βιοδεικτών στην ορολογική διάγνωση της νόσου. Στο δεύτερο μέρος, γίνονται προσπάθειες για τον εντοπισμό νέων αυτοαντισωμάτων έναντι των νευρωνικών nAChR, σε ορούς ασθενών με αυτοάνοση εγκεφαλίτιδα και τα συναφή της σύνδρομα (ΑΕΣ). Η εύρεση νέων αυτοαντισωμάτων και η απόδειξη της παθογένειάς τους, τα καθιστά νέους βιοδείκτες, απαραίτητους για την ορολογική επιβεβαίωση της διάγνωσης για την ασθένεια αυτή.
Η βαριά μυασθένεια είναι μια πρότυπη αυτοάνοση νευρολογική νόσος, η οποία προκαλείται από αυτοαντισώματα που στοχεύουν πρωτεΐνες της μετασυναπτικής μεμβράνης της νευρομυϊκής σύναψης. Στο μεγαλύτερο ποσοστό των ασθενών (80-85%) εντοπίζονται αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού nAChR, τα οποία χρησιμοποιούνται ως βιοδείκτες για την ορολογική διάγνωση της νόσου. Κλινικά, παρατηρείται ετερογένεια στην εμφάνιση της νόσου, η οποία δεν εξηγείται από τη διαφορά στον τίτλο των αντισωμάτων. Πιθανότατα, οι εμπορικά διαθέσιμες διαγνωστικές μέθοδοι αδυνατούν να διαχωρίσουν διαφορετικές κατηγορίες αντισωμάτων, οι οποίες όπως φαίνεται από μελέτες κυρίως σε ζωικά μοντέλα, παρουσιάζουν διαφορετική παθογονικότητα. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η ανάλυση των αντι-nAChR αυτοαντισωμάτων βάσει της αναγνώρισης: α) ενδοκυττάριων ή εξωκυττάριων επιτόπων του υποδοχέα και β) έναντι διαφορετικών υπομονάδων του ετεροπενταμερούς υποδοχέα. Για την επίτευξη αυτού του στόχου συνδυάστηκαν διαφορετικές μέθοδοι ανίχνευσης αντισωμάτων και αναλύθηκαν πολλαπλές αιμοληψίες από 21 μυασθενείς (συνολικά 60 ορολογικά δείγματα). Με βάση την πιο πάνω ανάλυση, βρέθηκε ότι 7 μυασθενείς είχαν αυτοαντισώματα κυρίως έναντι ενδοκυττάριων επιτόπων του υποδοχέα, τα οποία δεν θεωρούνται παθογόνα και όντως, οι ασθενείς αυτοί είχαν ήπιας μορφής νόσο. Όσον αφορά στους μυασθενείς που είχαν αυτοαντισώματα έναντι εξωκυττάριων επιτόπων του υποδοχέα, βρέθηκε ότι η αύξηση των αντι-α1 αυτοαντισωμάτων σε διαφορετικές χρονικές περιόδους, είχε ως αποτέλεσμα την επιδείνωση της κλινικής τους εικόνας. Αντίθετα, η αύξηση αντισωμάτων έναντι μη-α1 υπομονάδων συσχετίστηκε με μη επιδείνωση των κλινικών συμπτωμάτων των ασθενών. Επιπρόσθετα, η ύπαρξη αντισωμάτων μόνο έναντι μη-α1 υπομονάδων σε όλες τις αιμοληψίες συνδυάστηκε με ήπιας μορφής νόσο. Επομένως, φαίνεται ότι η ανάλυση των αντι-nAChR αυτοαντισωμάτων μπορεί να συμβάλλει στη μακροχρόνια παρακολούθηση αυτών των ασθενών, προσφέροντας πληροφορίες σχετικές με πιθανές μεταβολές των παθογόνων και μη παθογόνων αυτοαντισωμάτων κατά την πορεία της νόσου.
Η ΑΕΣ είναι μια μεγάλη ομάδα ασθενειών που προκαλούνται από αυτοαντισώματα έναντι αντιγόνων του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ). Η γενική συμπτωματολογία αυτών των νοσημάτων περιλαμβάνει νευρολογικά και ψυχιατρικά συμπτώματα, τα οποία όμως μπορούν να αντιμετωπιστούν με ανοσοθεραπείες. Στο ΚΝΣ εκφράζονται οι νευρωνικού τύπου nAChR σε υψηλά επίπεδα, κυρίως οι υπότυποι α7 και α4β2, οι οποίοι κατέχουν σημαντικό ρόλο στη διανευρωνική επικοινωνία. Η έκφραση ή/και η λειτουργία των νευρωνικών nAChR έχει φανεί σε αρκετές μελέτες ότι επηρεάζεται σε νευρολογικές και ψυχιατρικές ασθένειες, οι οποίες έχουν κοινή συμπτωματολογία με την ΑΕΣ. Τα πιο πάνω οδήγησαν στην υπόθεση ότι οι νευρωνικοί nAChR είναι αυτοαντιγόνα στην ΑΕΣ και επομένως, ο δεύτερος στόχος της διατριβής ήταν η ανίχνευση αυτοαντισωμάτων έναντι των νευρωνικών nAChR σε ορούς ασθενών με πιθανή ΑΕΣ. Για τον εντοπισμό αυτών των αυτοαντισωμάτων σε ορούς ασθενών, αναπτύχθηκαν ειδικές διαγνωστικές δοκιμασίες ανοσοφθορισμού σε κύτταρα. Αρχικά, για να προσδιοριστούν οι κατάλληλες συνθήκες για έκφραση των διαφορετικών υποτύπων του υποδοχέα, δοκιμάστηκαν διαφορετικοί συνδυασμοί υπομονάδων μαζί με πρωτεΐνες-συνοδούς. Μετά από την επιτυχή έκφραση των υποτύπων α4β2, α4β4 και α7 nAChR, συνεχίστηκε η ανάπτυξη των δοκιμασιών με τον έλεγχο της ειδικότητάς τους. Έτσι, ελέγχθηκαν οροί από υγιείς δότες και ασθενείς με άλλα αυτοάνοσα νευρολογικά νοσήματα, στους οποίους δεν εντοπίστηκαν αυτοαντισώματα έναντι αυτών των υποτύπων του υποδοχέα, κάτι που υποδεικνύει ότι οι δοκιμασίες είναι ειδικές και δεν οδηγούν σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Στη συνέχεια, εξετάστηκαν οροί από ασθενείς με πιθανή ΑΕΣ (συνολικά 1088 οροί) και βρέθηκαν 17 οροί θετικοί για αυτοαντισώματα έναντι της α4 ή της α7 υπομονάδας του υποδοχέα (16 θετικοί για αντι-α4 και 1 θετικός για αντι-α7). Για τους οροθετικούς ασθενείς, εξετάστηκε σε ποια κατηγορία ανοσοσφαιρινών ανήκουν τα αυτοαντισώματα και βρέθηκε ότι οι 10 ασθενείς έχουν αυτοαντισώματα που ανήκουν σε τάξεις ανοσοσφαιρινών, ικανών για την ενεργοποίηση του συμπληρώματος. Βάσει των πιο πάνω αποτελεσμάτων και σε συνδυασμό με τα διαθέσιμα κλινικά στοιχεία για τους οροθετικούς ασθενείς, φαίνεται ότι τα αντι-α4 αυτοαντισώματα είναι πιθανοί βιοδείκτες στην ΑΕΣ. Για την κλινική αξιοποίηση αυτών των αποτελεσμάτων, απαιτούνται επιπλέον μελέτες που θα εξετάσουν τον πιθανό παθογόνο ρόλο αυτών των αυτοαντισωμάτων και θα αποδείξουν την καταλληλότητά τους στη διάγνωση της νόσου.
Εν κατακλείδι, στην παρούσα διατριβή έχουν αναπτυχθεί μεθοδολογίες κατάλληλες για εντοπισμό αυτοαντισωμάτων και χρήσιμες στη διάγνωση νευρολογικών ασθενειών. Συγκεκριμένα, στο πρώτο μέρος περιγράφεται ένας νέος τρόπος ανάλυσης και κατηγοριοποίησης των αντι-nAChR αυτοαντισωμάτων στη βαριά μυασθένεια, ο οποίος μπορεί να συμβάλλει στην αποτελεσματικότερη χρήση των αυτοαντισωμάτων αυτών, ως βιοδεικτών στη νόσο. Στο δεύτερο μέρος αναπτύχθηκαν ειδικές δοκιμασίες για εντοπισμό αυτοαντισωμάτων έναντι των υποτύπων α4β2, α4β4 και α7 του νευρωνικού nAChR, με τις οποίες ελέγχθηκαν οροί από ασθενείς με πιθανή ΑΕΣ. Κατά τον πιο πάνω έλεγχο εντοπίστηκαν ασθενείς με αυτοαντισώματα έναντι της α4 υπομονάδας, καθιστώντας τα αυτοαντισώματα αυτά πιθανούς βιοδείκτες για την ΑΕΣ.
