Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ανδρέας Σκορίλας, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας ΕΚΠΑ
Μαργαρίτης Αυγέρης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, ΕΚΠΑ
Χρήστος Κοντός, Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης (Bladder Cancer) αποτελεί το δεύτερο συχνότερο τύπο καρκίνου του ουροποιητικού συστήματος, μετά τον καρκίνο του προστάτη. Αποτελεί την έκτη πιο συχνή μορφή καρκίνου στον ανδρικό πληθυσμό και την ένατη αίτια θανάτου. Η επίπτωση της νόσου αυξάνεται σημαντικά με την ηλικία, ενώ οι άνδρες έχουν 3 με 4 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο ανάπτυξης της νόσου. Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης παρουσιάζει έντονη κλινική ετερογένεια, όσον αφορά την πρόγνωση και εξέλιξη της νόσου, την επιβίωση των ασθενών και την ανταπόκριση τους στην θεραπεία. Η πρόγνωση της νόσου είναι σημαντική για την εξατομικευμένη θεραπεία του ασθενούς και για την δημιουργία μεταθεραπευτικού πρωτοκόλλου παρακολούθησης. Οι προγνωστικοί δείκτες που υπάρχουν σήμερα αδυνατούν να προβλέψουν με βεβαιότητα την πορεία του ουροθηλιακού καρκίνου, με αποτέλεσμα να είναι απαραίτητη η μακροπρόθεσμη παρακολούθηση των ασθενών μεταθεραπευτικά μέσω επεμβατικών κυστεοσκοπίσεων, κυτταρολογικών εξετάσεων ούρων και CT/MRI(Computed tomography scan/Magnetic Resonance Imaging) Συνεπώς το κόστος για την θεραπεία και παρακολούθηση ασθενώνείναι πολύ υψηλό Η αποκωδικοποίηση της λειτουργίας των γονιδίων που συμμετέχουν στην νόσο και η εύρεση νέων ρυθμιστικών μορίων τα οποία αλληλοεπιδρούν με τα γονίδια αυτά, αποτελεί ένα πεδίο με έντονο ερευνητικό ενδιαφέρον που έχει ως στόχο την εύρεση νέων βιοδεικτών για την καλύτερη πρόγνωση των ασθενών και σχεδιασμό της θεραπείας τους.
Μη-κωδικά RNAs ονομάζονται τα RNAs τα οποία δεν κωδικοποιούν κάποια πρωτεΐνη, ενώ πολλά από αυτά έχουν ρυθμιστικούς ρόλους ή συμμετέχουν στην σύνθεση πρωτεϊνών. Σε αυτήν την κατηγορία ανήκουν τα μικρά RNAs (micro RNAs/miRNAs), καθώς και τα θραύσματα από tRNAs (tRNA-derived fragments/tRFs).
Τα miRNAs ορίζονται ως μονόκλωνα μη-κωδικά μόρια RNA, μεγέθους ~20 νουκλεοτιδίων τα οποία παράγονται ενδογενώς και μπορούν να ρυθμίσουν την έκφραση σε μεταμεταγραφικό επίπεδο. Το miR-146a έχει συσχετιστεί πολλές φορές με τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Συγκεκριμένα σε πολλές μελέτες έχει βρεθεί ότι έχει αυξημένη έκφραση στους καρκινικούς ιστούς των ασθενών, καθώς επίσης και στα ούρα τους.
Το 5΄-tRF-LysCTT αποτελεί ένα θραύσμα tRNA (tRNA-derived fragments/ tRFs), συγκεκριμένα προέρχεται από το tRNALysCCT. Το συγκεκριμένο tRF σε ιστολογικά δείγματα ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, όταν έχει υψηλή έκφραση φαίνεται να σχετίζεται με δυσμενή πρόγνωση της νόσου, με μυοδιηθητικό τύπο καρκίνο, με όγκους υψηλού βαθμού κακοήθειας κατά WHO 2004 και υψηλού κινδύνου σύμφωνα με την κατάταξη EORTC. Παράλληλα όσον αφορά τη την εξέλιξη μετά την θεραπεία, συσχετίστηκαν τα υψηλά επίπεδά του με την εξέλιξη της μη-μυοδιηθητικής νόσου σε μυοδιηθητική, καθώς και χειρότερη ολική επιβίωση και επιβίωση ελευθέρας νόσου σε ασθενείς με μυοδιηθητικό τύπο καρκίνο.
Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι ανάπτυξη πρωτοκόλλου για την μέτρηση των επιπέδων των μη-κωδικών RNAs, miR-146a και 5΄-tRF-LysCTT, στον ορό του αίματος ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης και την κλινική τους αξιολόγηση σαν βιοδείκτες υγρής βιοψίας.
Για το σκοπό της παρούσας εργασίας, έγινε δειγματοληψία ολικού αίματος από ασθενείς (n=41) με καρκίνο της ουροδόχου κύστης πριν την θεραπεία. Στην συνέχεια πραγματοποιήθηκε η κατάλληλη επεξεργασία για την απομόνωση του ορού από το ολικό αίμα. Ακολούθως πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη πρωτοκόλλου ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (real-time qPCR) για τον προσδιορισμό των επιπέδων των μη-κωδικών RNA, miR-146a και 5΄-tRF-LysCTT, στον ορό των ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, με τη βοήθεια της SYBR Green I και της σχετικής ποσοτικοποίησης 2-ΔΔCT. Τέλος πραγματοποιήθηκε εκτενής βιοστατιστική ανάλυση για την εκτίμηση της αξίας των μελετούμενων μορίων σε κλινικό επίπεδο και την δυνατότητα χρήσης τους ως προγνωστικούς δείκτες για την καλύτερη διαστρωμάτωση κινδύνου των ασθενών με ουροθηλιακό καρκίνο και την βελτίωση της πρόβλεψης της μεταθεραπευτικής πορείας της νόσου.
Ανάμεσα στα δύο μελετώμενα μη-κωδικά RNAs, miR-146a και 5΄-tRF-LysCTT, το miR-146a φάνηκε να έχει την τάση να είναι αυξημένο σε ασθενείς με υψηλό βαθμό κακοήθειας κατά WHO 2004 και σε ασθενείς με T1 στάδιο νόσου που χαρακτηρίστηκαν ως υψηλού βαθμού κακοήθειας. Στο δείγμα ασθενών που εξετάσαμε δεν φάνηκε να υπάρχει στατιστικά σημαντική διαφορά στα επίπεδα των δύο μη-κωδικών RNAs στον ορό ασθενών με καρκίνο της ουροδόχου κύστης, ανάμεσα στα διάφορα στάδια της νόσου, καθώς επίσης και ανάμεσα στους ασθενείς με μη-μυοδιηθητικό και μυοδιηθητικό τύπο καρκίνου. Επίσης δεν εντοπίστηκε διαφορά μεταξύ των ασθενών υψηλού και χαμηλού βαθμού κακοήθειας, παρα μόνο η τάση αύξησης του miR-146a στους ασθενείς με υψηλού βαθμού κακοήθειας όγκο. Τέλος κανένα από τα δύο μη-κωδικά RNAs δεν συσχετίστηκε με καλύτερη ή χειρότερη επιβίωση ελευθέρας νόσου και την επιβίωση ελευθέρας εξέλιξης στους ασθενείς με μη-μυοδιηθητικό τύπο καρκίνου, ενώ το ίδιο παρατηρήθηκε και για την ολική επιβίωση των ασθενών με μυοδιηθητικό καρκίνο.
Συνεπώς τα δύο μη-κωδικά RNAs που εξετάσαμε δεν εμφάνισαν διαφορές στην ομάδα ασθενών που εξετάσαμε. Με μόνη εξαίρεση το miR-146a το οποίο είχε την τάση να έχει αυξημένα επίπεδα σε ασθενείς με υψηλό βαθμό κακοήθειας κατά WHO 2004 και σε ασθενείς σταδίου T1 και υψηλού βαθμού κακοήθειας. Μ ε βάση τα προηγούμενα αποτελέσματα πειραμάτων που έχουν γίνει στο εργαστήριο, αλλά και τη υπάρχουσα βιβλιογραφία, η συλλογή, η απομόνωση και ανάλυση περισσότερων δειγμάτων ασθενών θα ήταν καθοριστική για την χρήση των μορίων αυτών στην κλινική αξιολόγηση των ασθενών μέσω της υγρής βιοψίας.
