Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
1. Ντότσικα Ελένη (επιβλέπουσα): Διευθύντρια Ερευνών, Τμήμα Μικροβιολογίας,
Εργαστήριο Κυτταρικής Ανοσολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
2. Σκαλτσούνης Αλέξιος - Λέανδρος: Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας
Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Ε.Κ.Π.Α.
3. Χαλαμπαλάκη Μαρία: Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας
Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Ε.Κ.Π.Α.
4. Μητάκου Σοφία: Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας Φαρμακογνωσίας και
Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Ε.Κ.Π.Α.
5. Ρούτσιας Ιωάννης: Επίκουρος Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Εργαστήριο Μικροβιολογίας,
Ε.Κ.Π.Α.
6. Παπαδόπουλος Ηλίας: Καθηγητής, Κτηνιατρική Σχολή, Εργαστήριο Παρασιτολογίας &
Παρασιτικών Νοσημάτων, Α.Π.Θ.
7. Σμυρλή Δέσποινα: Κύρια Ερευνήτρια, Τμήμα Μικροβιολογίας, Εργαστήριο Μοριακής
Παρασιτολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Περίληψη:
Η λεϊσμανίαση αποτελεί μία πολυσυστηματική παρασιτική νόσο με ένα ευρύ φάσμα κλινικών συμπτωμάτων, όπως χρόνιων φλεγμονών του δέρματος και των σπλαγχνικών οργάνων, που μπορεί να είναι θανατηφόρος αν δεν θεραπευτεί έγκαιρα. Επηρεάζει 12 εκατομμύρια ανθρώπους παγκοσμίως, ενώ 0,7 - 1,2 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις αναφέρονται ετησίως από σχεδόν 100 ενδημικές χώρες. Πρόκειται για μια ενδημική νόσο της Νοτίου Ευρώπης με προοδευτικά αυξανόμενη συχνότητα και στις μη ενδημικές περιοχές, θέτοντας πρόβλημα δημόσιας υγείας. Προκαλείται από περισσότερα από 21 διαφορετικά είδη μονοκύτταρων πρωτόζωων παρασίτων του γένους Leishmania, της οικογένειας των τρυπανοσωματιδών (Trypanosomatidae), που μεταδίδονται στους τελικούς σπονδυλωτούς ξενιστές τους μέσω του δήγματος των μολυσμένων θηλυκών εντόμων της οικογένειας των ψυχοειδών (γένη Phlebotomus και Lutzomyia), τα οποία εισερχόμενα στην κυκλοφορία του αίματος μολύνουν τα μονοπύρηνα φαγοκύτταρα του ξενιστή. Κύριοι ξενιστές του παρασίτου αποτελούν ο άνθρωπος, είδη της οικογένειας των κυνιδών και τα τρωκτικά. Η βαρύτητα των κλινικών εκδηλώσεων της νόσου εξαρτάται τόσο από το είδος του παρασίτου, όσο και από την γενετική προδιάθεση και την ανοσοϊκανότητα του προσβεβλημένου ξενιστή, όπως αυτό αποδεικνύεται στα μοντέλα ζωικών προτύπων που είναι διαθέσιμα. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει εμπορικά διαθέσιμο αποτελεσματικό εμβόλιο, η χημειοθεραπεία αποτελεί τη μόνη θεραπευτική επιλογή για τη νόσο. Οι διαθέσιμες χημειοθεραπείες και συνδυαστικές θεραπείες περιλαμβάνουν φάρμακα, όπως η πενταμιδίνη, η παρομομυκίνη, διάφορες αζόλες, η λιποσωμιακή αμφοτερικίνη Β και η μιλτεφοσίνη. Ωστόσο, όλες αυτές οι επιλογές παρουσιάζουν σημαντικές παρενέργειες, όπως τοξικότητα, υψηλό κόστος και αυξανόμενο ποσοστό αποτυχίας, που οφείλεται κυρίως στην ανάπτυξη αντοχής του παρασίτου. Συνεπώς, καθίσταται αναγκαία η διερεύνηση νέων δραστικών αντιλεϊσμανιακών ουσιών και νέων αποτελεσματικών πρωτοκόλλων θεραπείας.
Σύγχρονες επιδημιολογικές μελέτες αναδεικνύουν πως η Μεσογειακή διατροφή συνδέεται με μειωμένη συχνότητα εμφάνισης χρόνιων φλεγμονωδών νοσημάτων όπως, καρδιαγγειακές παθήσεις, νευρολογικές διαταραχές και ορισμένοι τύποι καρκίνου. Βασικό συστατικό της αποτελεί το ελαιόλαδο και ειδικότερα το εξαιρετικά παρθένο ελαιόλαδο (extra virgin olive oil, EVOO), το οποίο προέρχεται από το φυτό Olea europaea L. Πολυάριθμες μελέτες σε in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα αποδίδουν τις ευεργετικές επιδράσεις του ελαιολάδου στα μονοακόρεστα λιπαρά οξέα (monounsaturated fatty acids, ΜUFAs) και στο πολικό του κλάσμα (total phenolic fraction, TPF), στο οποίο εμπεριέχονται ποικίλες βιοφαινόλες, όπως φαινυλικές αλκοόλες, φαινολικά οξέα, σεκοϊριδοειδή, φλαβονοειδή και λιγνάνες. Συνεπώς, η κατανάλωση ελαιολάδου, του ακρογωνιαίου λίθου της Μεσογειακής διατροφής, συσχετίζεται με ευεργετικές για την υγεία ιδιότητες, όπως αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις και αντικαρκινικές. Πρόσφατα, η Ευρωπαϊκή Επιτροπή Ασφάλειας Τροφίμων (EFSA) γνωμοδότησε σχετικά με τη θετική συμβολή των βιοφαινολών του ελαιολάδου στην υγεία του ανθρώπου. Επομένως, η διερεύνηση του ρόλου αυτών των βιοδραστικών μορίων του ελαιόλαδου στη θεραπεία ενδημικών λοιμωδών νοσημάτων, στις χώρες της Νοτίου Ευρώπης που είναι οι κύριες ελαιοπαραγωγικές χώρες παγκοσμίως με την υψηλότερη κατά κεφαλή κατανάλωση ελαιολάδου, είναι ιδιαίτερου επιστημονικού ενδιαφέροντος.
Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η συγκριτική μελέτη των αντιλεϊσμανιακών ιδιοτήτων δύο ολικών φαινολικών κλασμάτων, TPF1 και TPF2, προερχόμενα από ελληνικά EVOOs, με διαφορετική πολυφαινολική σύσταση, καθώς και η συσχέτιση τόσο αυτών όσο και τεσσάρων βασικών απομονωμένων πολυφαινολικών τους συστατικών, με το εμπορικά διαθέσιμο αντιλεϊσμανιακό φάρμακο μιλτεφοσίνη (HePC), σε in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα της νόσου.
Η ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι το TPF2 ήταν πλουσιότερο σε φαινολικές ενώσεις, καθώς περιείχε υδροξυτυροσόλη (HT) (5 mg/g εκχυλίσματος), τυροσόλη (Τ) (12 mg/g), ολεασεΐνη (OLEA) (144 mg/g) και ολεοκανθάλη (OLEO) (301 mg/g), ενώ το TPF1 περιείχε ΗΤ και Τ στα 7 και 42 mg/g εκχυλίσματος, αντίστοιχα. Παρά τη διαφορετική τους φαινολική σύσταση, και τα δύο TPF άσκησαν ισχυρή αντιλεϊσμανιακή δράση έναντι δύο ειδών του γένους Leishmania, των L. infantum και L. major, τα οποία αποτελούν αιτιολογικούς παράγοντες της σπλαγχνικής και της δερματικής μορφής της νόσου, αντίστοιχα. Ωστόσο, το TPF2 επέδειξε ισχυρότερες αντιλεϊσμανιακές ιδιότητες. Ομοίως, οι απομονωμένες πολυφαινολικές τους ενώσεις, ολευρωπεΐνη (OLE), HT, OLEA και OLEO, επέδειξαν σημαντική αντιλεϊσμανιακή δράση και στα δύο μοντέλα. Επίσης, με εξαίρεση την OLE, όλες οι εξεταζόμενες ουσίες εμφάνισαν χαμηλή τοξικότητα έναντι των μακροφάγων και σαφή εκλεκτικότητα έναντι του Leishmania spp.
Η παρούσα διατριβή στη συνέχεια εστίασε στη συγκριτική μελέτη των δύο ολικών φαινολικών κλασμάτων, προσδιορίζοντας τον τύπο του επαγόμενου κυτταρικού θανάτου σε προμαστιγώτες Leishmania spp. Ειδικότερα, στους εξωκυττάριους προμαστιγώτες προσδιορίστηκαν χαρακτηριστικοί μορφολογικοί και βιοχημικοί δείκτες αποπτωτικού θανάτου.
Η αυξανόμενη ανθεκτικότητα του παρασίτου στα διαθέσιμα αντιλεϊσμανιακά φάρμακα που χρησιμοποιούνται για πολλές δεκαετίες, οδηγεί αναπόφευκτα στην αναζήτηση νέων αποτελεσματικών θεραπευτικών ουσιών ή συνδυαστικών δοσολογικών σχημάτων. Τα τελευταία χρόνια η συνδυαστική χρήση φαρμάκων υποστηρίζεται όλο και περισσότερο ως ένας τρόπος για την αύξηση της αποτελεσματικότητας, τη μείωση της διάρκειας και του κόστους της θεραπείας και τον περιορισμό της ανθεκτικότητας. Στην παρούσα διατριβή αξιολογήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις καθεμίας βιοφαινολικής ένωσης με τη HePC, με απώτερο στόχο τη βελτιστοποίηση της απόδοσης της HePC, του μοναδικού εγκεκριμένου από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) σκευάσματος που χορηγείται δια στόματος για τη θεραπεία της λεϊσμανίασης. Η αξιολόγηση της φύσης της αλληλεπίδρασης πραγματοποιήθηκε σε in vitro συστήματα εξωκυττάριων προμαστιγωτών και ενδοκυττάριων αμαστιγωτών Leishmania, με βάση την τροποποιημένη μέθοδο ισοβολογράμματος. Τα αποτελέσματα στο σύστημα των προμαστιγωτών L. infantum και L. major αποκάλυψαν αθροιστικότητα για τις αλληλεπιδράσεις HePC-TPF1 και HePC-TPF2, συνέργεια για την αλληλεπίδραση HePC-OLEΟ, αδιαφορία για HePC-HT και HePC-OLEA και ανταγωνισμό για HePC-OLE. Μεταξύ αυτών, τα αποτελέσματα που οδήγησαν σε συνέργεια και αθροιστικότητα χαρακτηρίστηκαν ως τα πιο υποσχόμενα, καθώς προκάλεσαν σημαντική μείωση στη δοσολογία της HePC. Οι υποσχόμενες αυτές αλληλεπιδράσεις επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω από την ενισχυμένη ενδοκυττάρια παραγωγή ROS στους εξωκυττάριους προμαστιγώτες. Ακολούθησε η διερεύνηση του είδους των αλληλεπιδράσεών τους με τη HePC και στο σύστημα των ενδοκυττάριων αμαστιγωτών, όπου τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ανταγωνισμό και στα δύο είδη του παρασίτου. Επιπλέον, σε in vitro σύστημα Leishmania – μολυσμένων μακροφάγων αναδείχθηκε η ανοσορυθμιστική δράση και των τριών βιοφαινολικών ενώσεων, TPF1, TPF2 και OLEO, η οποία στην πλειονότητα των δοκιμασιών ενισχύθηκε όταν οι ενώσεις αυτές συνδυάστηκαν με τη HePC.
Το σύνολο των ανωτέρω αποτελεσμάτων ανέδειξε την OLEO ως το πιο πολλά υποσχόμενο μόριο και οδήγησε στην επιλογή της για την περαιτέρω εφαρμογή της σε in vivo πειραματικό μοντέλο δερματικής λεϊσμανίασης, προκειμένου να αξιολογηθεί τόσο η μονήρης, όσο και η συνδυαστική με τη HePC θεραπευτική της δράση.
Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης επαλήθευσαν ότι τα ολικά φαινολικά κλάσματα του ελαιολάδου αποτελούν βιοενεργά εκχυλίσματα με ισχυρή αντιλεϊσμανιακή και ανοσοτροποποιητική δράση. Επιπλέον, ανέδειξαν ότι τα κλάσματα που είναι πλουσιότερα στις φαινολικές ενώσεις OLEA και OLEO, εστέρες των ΗΤ και Τ, αντίστοιχα, έχουν ισχυρότερη αντιλεϊσμανιακή δράση. Η παραδοχή αυτή επιβεβαιώθηκε περαιτέρω από τη διερεύνηση της λεϊσμανιοκτόνου δράσης των απομονωμένων πολυφαινολών, όπου η OLEO έδωσε τα πιο υποσχόμενα αποτελέσματα μεταξύ των υπό μελέτη καθαρών ενώσεων. Επίσης, η συσχέτιση των βιοενεργών φυσικών συστατικών με τη HePC, έδειξε μία υποσχόμενη θεραπευτική προσέγγιση έναντι των παρασίτων, υποδεικνύοντας νέα θεραπευτικά πρωτόκολλα που μπορούν να καθορίσουν πιθανά αποτελεσματικά δοσολογικά σχήματα που σχετίζονται με τη βέλτιστη χαμηλότερη δόση του τυπικού φαρμάκου. Η στρατηγική της συνδυαστικής χημειοθεραπείας ενθαρρύνει την μελλοντική επίτευξη αυτής της στρατηγικής για την αντιμετώπιση της νόσου σε δύσκολες κλινικές περιπτώσεις υποτροπών, σε περιπτώσεις ασθενών που δεν ανταποκρίνονται στην αρχική διαθέσιμη χημειοθεραπεία, καθώς και σε περίπλοκες καταστάσεις όπως η συλλοίμωξη με τον ιό HIV.
