Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Γ. Διαλλινάς, Καθηγητής, Πανεπιστήμιο Αθηνών (Επιβλέπων)
Σ. Ευθυμιόπουλος, Καθηγητής, Πανεπιστήμιο Αθηνών
P. Ljungdahl, Καθηγητής, Πανεπιστήμιο της Στοκχόλμης
Δ. Χατζηνικολάου, Αναπληρωτής Καθηγητής, Πανεπιστήμιο Αθηνών
Χ. Αλεξόπουλος, Επίκουρος Καθηγητής, Πανεπιστήμιο Αθηνών
Χ. Δελιδάκης, Καθηγητής, Πανεπιστήμιο Κρήτης
Σ. Χριστοφορίδης, Καθηγητής, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων
Περίληψη:
Οι πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης είναι απαραίτητες σε όλους τους οργανισμούς, καθώς μεσολαβούν στην πρόσληψη θρεπτικών, την επικοινωνία των κυττάρων αλλά και την απόκριση σε φυσιολογικά ερεθίσματα ή στρεσογόνους παράγοντες. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, το πρώτο βήμα στη βιογένεσή τους είναι η συμμεταφραστική τους μετατόπιση από τα ριβοσώματα στη μεμβράνη του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ). Σύμφωνα με την τρέχουσα γνώση, οι πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης εξέρχονται από το ΕΔ μέσα σε κυστίδια COPII, τα οποία συντήκονται στο cis-Golgi και έπειτα φτάνουν μέσω ωρίμανσης του συμπλέγματος Golgi στο trans-Golgi, από όπου αποστέλλονται στην πλασματική μεμβράνη. Η διαμεσολαβούμενη σύντηξη κυστιδιακών δομών και μεμβρανών-στόχων πραγματοποιείται από πρωτεΐνες SNAREs, πρωτεΐνες πρόσδεσης, μικρές GTPases και άλλους ρυθμιστικούς παράγοντες. Αυτή η οδός διακίνησης, που συχνά αναφέρεται ως συμβατική οδός έκκρισης πρωτεϊνών, θεωρείται ως το κύριο μονοπάτι για την υποκυτταρική διακίνηση των περισσότερων πρωτεϊνών της πλασματικής μεμβράνης. Ωστόσο, νέα δεδομένα από διαφορετικές ερευνητικές ομάδες έχουν αρχίσει να αμφισβητούν πτυχές της συμβατικής οδού διακίνησης των μεμβρανικών πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, σε αρκετές περιπτώσεις, έχει δειχθεί ότι κάποιες πρωτεΐνες ακολουθούν μια μη-συμβατική οδό, παρακάμπτοντας την έκκριση μέσω κυστιδίων ή τη διακίνησή μέσω του συμπλέγματος Golgi, στην πορεία τους προς την πλασματική μεμβράνη. Παραδόξως, ελάχιστες έρευνες έχουν μελετήσει τον μηχανισμό βιογένεσης των πιο άφθονων πρωτεϊνών της πλασματικής μεμβράνης, όπως των μεταφορέων, των υποδοχέων ή των καναλιών.
Οι νηματοειδείς μύκητες, όπως οι Aspergillus nidulans, Neurospora crassa ή Ustilago maydis, έχουν αναδειχθεί ως πρότυποι οργανισμοί για την in vivo διεξαγωγή πειραμάτων κυτταρικής βιολογίας. Λόγω του πολικού τρόπου ανάπτυξής τους, όπως συμβαίνει και στα περισσότερα πολικά κύτταρα ζώων και φυτών, οι νηματοειδείς μύκητες πρέπει να ρυθμίσουν τη στόχευση και την κατανομή των πρωτεϊνών σε συγκεκριμένες περιοχές της κορυφαίας ή της πλαγιοβασικής μεμβράνης. Για παράδειγμα, όπως έχουμε δείξει στο εργαστήριό μας, οι μεταφορείς θρεπτικών ουσιών στον A. nidulans είναι ομοιογενώς κατανεμημένοι καθ’ όλο το μήκος της πλασματικής μεμβράνης, ενώ οι μεμβρανικές πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αύξηση τοποθετούνται πολικά και διατηρούνται στην αναπτυσσόμενη άκρη των υφών. Επιπλέον, έχουμε δείξει, όπως και άλλες ομάδες που μελετούν νηματοειδείς μύκητες, ότι οι πρωτεΐνες που τοποθετούνται πολικά στην ακραία περιοχή της πλασματικής μεμβράνης του A. nidulans ακολουθούν τη συμβατική, εξαρτώμενη από το σύμπλεγμα Golgi, εκκριτική οδό,
όπως άλλωστε συμβαίνει και σε ζύμες και πολικά κύτταρα θηλαστικών. Αντιθέτως, καμία μελέτη σε νηματοειδείς μύκητες, ζύμες ή κάποιο άλλο σύστημα, δεν έχει εξετάσει πώς διακινούνται στην πλασματική μεμβράνη οι μεταφορείς θρεπτικών ουσιών ή άλλες μεμβρανικές πρωτεΐνες που δεν εμφανίζουν πολική κατανομή.
Στο πρώτο μέρος της παρούσας διατριβής, αναπτύξαμε ένα νέο γενετικό σύστημα για τη μελέτη της διακίνησης διαμεμβρανικών μεταφορέων θρεπτικών ουσιών στον A. nidulans. Χρησιμοποιώντας ως πρότυπο μη-πολικής μεμβρανικής πρωτεΐνης τον εξαιρετικά μελετημένο μεταφορέα ουρικού οξέος/ξανθίνης UapA, αλλά στη συνέχεια και άλλους μεταφορείς, συλλέξαμε πειραματικά στοιχεία που δείχνουν ότι η διακίνηση νεοσυντιθέμενων μεταφορέων, μετά την έξοδο από το ΕΔ σε κυστίδια COPII, πραγματοποιείται μέσω ενός μηχανισμού που παρακάμπτει το σύμπλεγμα Golgi. Αυτά τα απροσδόκητα αποτελέσματα υποστηρίζουν σθεναρά την ύπαρξη διακριτών μηχανισμών εξόδου από το ΕΔ, ειδικών για την εκάστοτε πρωτεΐνη ή/και εναλλακτικών πληθυσμών κυστιδίων COPII. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, επεκτείναμε την πειραματική μας προσέγγιση σε ζωτικής σημασίας πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης, όπως η αντλία πρωτονίων PmaA και η σχετιζόμενη με τη ρύθμιση του pH πρωτεΐνη PalI, οι οποίες διαφέρουν από τους μεταφορείς θρεπτικών ουσιών σε πολλούς τομείς, σχετικούς με τη δομή και τη φυσιολογική λειτουργία τους, διατηρώντας όμως και αυτές μια μη πολική κατανομή στην πλασματική μεμβράνη. Δείξαμε ότι οι πρωτεΐνες αυτές, όπως και οι μεταφορείς, παρακάμπτουν το σύμπλεγμα Golgi κατά τη βιοσύνθεσή τους, γεγονός που υποδηλώνει ότι όλες οι πρωτεΐνες που είναι μη-πολικά κατανεμημένες στην πλασματική μεμβράνη διακινούνται μέσω ενός μη-συμβατικού μηχανισμού ανεξάρτητου του Golgi.
Στο τρίτο μέρος της διδακτορικής διατριβής, αναζητήσαμε πρωτεΐνες που μπορεί να είναι σημαντικές για τη διάκριση μεταξύ της ανεξάρτητης και της εξαρτώμενης από το Golgi οδού διακίνησης πρωτεϊνών. Ως πρώτη προσέγγιση, πραγματοποιήσαμε μια σειρά γενετικών πειραμάτων διαλογής μεταλλαγών χρησιμοποιώντας ως πρότυπη μη-συμβατικά εκκρινόμενη πρωτεΐνη τον μεταφορέα UapA του οποίου περιπτώσεις ελλαττωματικής στόχευσης στη μεμβράνη είναι δυνατόν να αναγνωριστούν μέσω μη-φυσιολογικής ανάπτυξης σε θρεπτικό μέσο που εμπεριέχει υποστρώματα (π.χ. ουρικό οξύ) η τοξικά ανάλογα υποστρωμάτων του μεταφορέα. Ωστόσο, μέσω αυτών των γενετικών πειραμάτων, απομονώσαμε κυρίως μεταγραφικές ή μεταφραστικές μεταλλαγές που οδηγούν στη μη-έκφραση του UapA. Δυστυχώς, δεν πήραμε καμία μεταλλαγή που να επηρεάζει τη διακίνηση του UapA στην πλασματική μεμβράνη. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι οι παράγοντες που εμπλέκονται στο μονοπάτι που παρακάμπτει το σύμπλεγμα Golgi φαίνεται
να είναι απαραίτητοι για την επιβίωση του κυττάρου, και έτσι μελλοντικά αντίστοιχα πειράματα θα πρέπει να επανασχεδιαστούν με σκοπό την επιλογή μεταλλαγών που οδηγούν σε υπομορφικούς φαινοτύπους (conditional ή hypomorphic). Σαν εναλλακτική προσέγγιση για τον εντοπισμό πρωτεϊνών που μπορεί να εμπλέκονται στο μονοπάτι που παρακάμπτει το σύμπλεγμα Golgi, χρησιμοποιήσαμε τη μέθοδο Proximity Dependent Biotinylation (PDB) σε συνδυασμό με πρωτεομική ανάλυση. Κατά βάση αναμέναμε να εντοπίσουμε πρωτεΐνες που αλληλοεπιδρούν παροδικά με τον UapΑ κατά τη διάρκεια της διαδρομής του από το ΕΔ στην πλασματική μεμβράνη. Η βελτιστοποίηση αυτής της τεχνικής κατά τη διάρκεια της παρούσας διατριβής έχει ήδη θέσει τα θεμέλια για να τον εντοπισμό των προαναφερθέντων πρωτεϊνών. Ως τρίτη προσέγγιση, πραγματοποιήσαμε μια συστηματική ανάλυση πρωτεϊνών που είναι ήδη γνωστό ότι εμπλέκονται στη συμβατική διαδικασία πρωτεϊνικής διακίνησης. Η ανάλυση αυτή αποκάλυψε ότι οι πρωτεΐνες Sec12 και Ykt6, που συμμετέχουν στη βιογένεση των COPII κυστιδίων και στη σύντηξη μεμβρανών, αντίστοιχα, είναι πράγματι σημαντικές για τη διάκριση μεταξύ του μονοπατιού που εξαρτάται από το σύμπλεγμα Golgi και αυτού που το παρακάμπτει.
Στο τέταρτο μέρος της διατριβής, χρησιμοποιήσαμε τεχνική μικροσκοπίας υψηλής ευκρίνειας, συγκεκριμένα την Photoactivated Localization Microscopy (PALM), με σκοπό την λεπτομερή ανάλυση των μεμβρανικών δομών που διακινούν τον μεταφορέα UapA. Μέσω αυτής επιβεβαιώσαμε ότι οι βασικοί τελεστές του συμπλέγματος Golgi (SedV, RabE) είναι περιττοί ενώ η Qa-SNARE SsoA είναι απολύτως αναγκαία για την τελική μετατόπιση του UapA στην πλασματική μεμβράνη. Επιπλέον, δείξαμε ότι οι μεμβρανικές δομές που εμπεριέχουν τον UapA παρακάμπτουν το σύμπλεγμα Golgi επιτελούν μια ταχύτατη (< 1 s) και σύντομη (< 1 μΜ) μετακίνηση προς την πλασματική μεμβράνη, σε αντίθεση με τους φορείς που εκκρίνονται μέσω του συμβατικού μονοπατιού, οι οποίοι διανύουν σημαντικές αποστάσεις κατά τη μεταφορά τους πάνω σε μικροσωληνίσκους, και κατ’ επέκταση εύκολα ανιχνεύσιμες.
Συνοψίζοντας, μέσα από αυτήν την εργασία, ανακαλύψαμε ένα νέο μονοπάτι για τη διακίνηση διαμεμβρανικών μη-πολικά κατανεμημένων πρωτεϊνών στον A. nidulans το οποίο είναι ανεξάρτητο από το σύμπλεγμα Golgi και αποκτήσαμε μια εικόνα για ορισμένα από τα χαρακτηριστικά του. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η παρακαμπτήρια από το σύμπλεγμα Golgi οδός φαίνεται να μην αποτελεί απλά μια ιδιαιτερότητα των μυκήτων, αλλά πιθανόν μία νέα βασική και οδό διακίνησης, εξειδικευμένη για την εκάστοτε πρωτεΐνη, στα ευκαρυωτικά κύτταρα, που μέχρι τώρα έχει αγνοηθεί.
