Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Σκαρλάτος Ντέντος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, ΕΚΠΑ
Παναγιώτα Παπαζαφείρη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, ΕΚΠΑ
Λασκαρώ Ζαγοραίου, Ερευνήτρια Γ', Τομέας Βασικών Νευροεπιστημών, Ι.ΙΒ.Ε.Α.Α.
Επαμεινώνδας Δοξάκης, Ερευνητής, Τομέας Βασικών Νευροεπιστημών, Ι.ΙΒ.Ε.Α.Α.
Σπυρίδων Ευθυμιόπουλος, Καθηγητής, Τμήμα βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, ΕΚΠΑ
Δημήτριος Ι. Στραβοπόδης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα βιολογίας, Σχολή Θετικών Επιστημών, ΕΚΠΑ
Κωνσταντίνος Παληκαράς, Επίκουρος Καθηγητής, Τομέας Βασικών Ιατρικών Επιστημών, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Τα μικρομοριακά RNAs (microRNAs ή miRNAs) αποτελούν μία ομάδα μικρών ρυθμιστικών μορίων RNA, μήκους 19-24 νουκλεοτιδίων, τα οποία δεσμεύονται σε συμπληρωματικές θέσεις κυρίως της 3’ αμετάφραστης περιοχής (3’ Untranslated Region, 3’UTR) των mRNAs-στόχων τους και προκαλούν την καταστολή της μετάφρασης και την αποσταθεροποίησή τους, συμμετέχοντας με τον τρόπο αυτό στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Μέχρι στιγμής, έχουν ταυτοποιηθεί πολλά miRNAs που είτε εκφράζονται αποκλειστικά στο νευρικό σύστημα ή τα επίπεδα έκφρασής τους είναι ιδιαιτέρως υψηλά σε συγκεκριμένους νευρικούς κυτταρικούς τύπους/πληθυσμούς νευρώνων, σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια, και ακόμη και σε συγκεκριμένα διαμερίσματα ενός νευρώνα, όπου διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και τη λειτουργία του νευρικού συστήματος. H δημιουργία, αλλά και η αναδιαμόρφωση της δομής και λειτουργίας των συνάψεων ως απόκριση στη νευρωνική δραστηριότητα, διαδικασίες που συμβάλλουν στην παγίωση της μνήμης και μάθησης, επιτυγχάνονται μέσω μίας σειράς μοριακών γεγονότων, που περιλαμβάνουν την ενεργοποίηση ιοντικών διαύλων και υποδοχέων και τη διακίνηση ιόντων διαμέσου αυτών, τη φωσφορυλίωση σηματοδοτικών μορίων και μεταγραφικών παραγόντων, τη μεταγραφή, καθώς και την τοπική μετάφραση των συναπτικών mRNAs στις δενδριτικές άκανθες. Ολοένα και αυξανόμενα δεδομένα συνηγορούν στο γεγονός ότι, τα miRNAs εμπλέκονται στον έλεγχο όλων των παραπάνω διαδικασιών, καθώς απαντούν σε διάφορα συναπτοδενδριτικά διαμερίσματα των νευρώνων και συμβάλλουν σημαντικά στη ρύθμιση της συναπτικής ισχύος και πλαστικότητας, ενώ παράλληλα η έκφρασή τους μεταβάλλεται από τους μοριακούς μηχανισμούς που συντονίζουν τη λειτουργία της σύναψης αλλά απορρυθμίζεται κατά τη νευροπαθολογία. Όλα τα παραπάνω επισημαίνουν τη ζωτική σημασία που έχουν τα miRNAs στην ανάπτυξη και την εύρυθμη λειτουργία του νευρικού συστήματος.
Με βάση τα παραπάνω, σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να διερευνηθεί ο ρόλος των νευρωνικών miRNAs στη μετα-μεταγραφική ρύθμιση της έκφρασης των ιοντικών διαύλων της πλασματικής μεμβράνης και του ενδοπλασματικού δικτύου (ΕΔ), που συντονίζουν τη συναπτική λειτουργία και κατέχουν κυρίαρχο ρόλο σε όλες τις θεμελιώδεις νευρωνικές διεργασίες. Συγκεκριμένα, η πειραματική μας μελέτη βασίστηκε σε τρεις άξονες που περιλαμβάνουν: α) τους διαύλους διαρροής ιόντων K+ TREK/TRAAK, β) τους υποδοχείς γλουταμινικού οξέος AMPA (a-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid Receptor), και γ) τους υποδοχείς ρυανοδίνης, RyR (Ryanodine Receptor), και 1,4,5-τριφωσφορικής ινοσιτόλης, IP3R (Inositol 1,4,5-triphosphate Receptor). Προκειμένου να εντοπιστούν πιθανές θέσεις πρόσδεσης των miRNAs στις 3’UTRs των υπό διερεύνηση mRNAs, αρχικά, πραγματοποιήθηκε συγκριτική βιοπληροφορική ανάλυση ανάμεσα σε πέντε βάσεις δεδομένων, η οποία αποκάλυψε ότι, τα miR-9, miR-96, miR-124, miR-128, miR-153, miR-182, miR-183 και miR-218 διαθέτουν πιθανές συμπληρωματικές θέσεις αναγνώρισης στις 3’UTRs των TREK1, TREK2, TRAAK, GluR1-4, RyR1-3 και IP3R1-3 mRNAs. Τα δεδομένα που προέκυψαν έπειτα από την ανάλυση της δοκιμασίας της λουσιφεράσης σε κύτταρα ΗΕΚ293 και SK-N-SH που υπερεξέφραζαν τα χιμαιρικά μετάγραφα ταυτόχρονα με τα miRNAs ή τους αναστολείς αυτών (TuD-miRNAs ή αντινοηματικά 2’-Ο-μεθυλ-ολιγονουκλεοτίδια), αντίστοιχα, απέδειξαν την ισχυρή αλληλεπίδραση μεταξύ του miR-183 και του TREK2 mRNA, του miR-128 και των TREK1, TREK2, GluR1 και GluR3 mRNAs, καθώς και του miR-218 και του GluR2 mRNA. Επιπλέον, επιβεβαιώθηκε ότι, το miR-124 αναγνωρίζει και προσδένεται ειδικά και ισχυρά σε συμπληρωματικές θέσεις στις 3’UTRs των TREK1, TREK2, GluR2-4, RyR1-3 και IP3R3 mRNAs, υποστηρίζοντας τον ρυθμιστικό του ρόλο στη χωροχρονική έκφραση της πλειονότητας των mRNAs που εξετάστηκαν. Περαιτέρω ανάλυση με τις τεχνικές RT-qPCR, ανοσοκυτταροχημείας και ανοσοαποτυπώματος κατά Western αποκάλυψε ότι, τα miRNAs αυτά καταστέλλουν την έκφραση των αντίστοιχων mRNAs-στόχων τους και επομένως προκαλούν σημαντική μείωση στα πρωτεϊνικά επίπεδα των υπομονάδων που συγκροτούν τους υπό μελέτη διαύλους-υποδοχείς.
Έχοντας επιβεβαιώσει την κατασταλτική τους δράση, στη συνέχεια διερευνήθηκε η συμβολή αυτών των miRNAs στις νευρωνικές διεργασίες που επάγονται από την ενεργοποίηση των διαύλων TREK/TRAAK και των υποδοχέων AMPA, RyR και IP3R τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες όσο και σε συνθήκες στρες. Όσον αφορά την περίπτωση των διαύλων TREK, αρχικά χρησιμοποιήθηκε η ηλεκτροφυσιολογική μέθοδος της καθήλωσης του δυναμικού σε τμήμα μεμβράνης (patch clamp) και διαπιστώθηκε ότι, η υπερέκφραση του miR-124 έχει ως αποτέλεσμα η ένταση του ρεύματος των ιόντων Κ+ που άγεται κατά τη θερμική ενργοποίηση του διαύλου TREK2 να είναι σημαντικά μειωμένη, γεγονός που απορρέει από τη μείωση που προκαλεί στην έκφραση του TREK2 mRNA, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω την κατασταλτική του δράση. Ακολούθως, έγινε προσπάθεια να συσχετιστεί η ενδογενής έκφραση των miRNAs και των διαύλων TREK1 και TREK2 στο κεντρικό (ΚΝΣ) και περιφερικό νευρικό σύστημα (ΠΝΣ) τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες όσο και σε καταστάσεις που σχετίζονται με την πρόκληση του νευροπαθητικού πόνου. Βρέθηκε ότι, τα miR-124, miR-128 και miR-183 και τα TREK1 και TREK2 mRNAs εμφανίζουν παρόμοιο πρότυπο έκφρασης κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου του ποντικού, αλλά και σε ώριμους νευρώνες των γαγγλίων της ραχιαίας ρίζας (Dorsal Root Ganglia, DRG). Τα δεδομένα που προέκυψαν από τη δοκιμασία της λουσιφεράσης σε ώριμους νευρώνες DRG που υπερεξέφραζαν τα TREK1 ή TREK2 και το TuD-124 ή TuD-128 επιβεβαίωσαν την κατασταλτική δράση του miR-124 και του miR-128 στην έκφραση των TREK1 και TREK2 mRNAs στους νευρώνες αυτούς. Τέλος, σε αντίθεση με ότι παρατηρήθηκε υπό φυσιολογικές συνθήκες, κατά την αλλαγή της φυσιολογίας αυτών των νευρώνων έπειτα από την επώασή τους με διάφορους προ-φλεγμονώδεις και αυξητικούς παράγοντες τα πρότυπα έκφρασης του miR-124 σε σχέση με αυτά των TREK1 και TREK2 mRNAs αντιστρέφονται. Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν ότι, το miR-124, και σε μικρότερο βαθμό τα miR-128 και miR-183, δρουν για να συντονίσουν, παρά να εξαλείψουν, την έκφραση και κατά συνέπεια τη δραστηριότητα των διαύλων TREK στο ΚΝΣ και ΠΝΣ, αναδεικνύοντάς τα ως πιθανούς φαρμακευτικούς στόχους για την αναλγησία και νευροπροστασία.
Στην περίπτωση των υποδοχέων ΑΜΡΑ, δεδομένης της ζωτικής σημασίας της ομοιόστασης των ιόντων Ca2+ στη φυσιολογική λειτουργία των νευρικών κυττάρων, καθώς και των βλαβερών επιπτώσεων της διατάραξής της, χρησιμοποιήθηκε η φθορισμομετρική μέθοδος της απεικόνισης των ιόντων Ca2+ σε πραγματικό χρόνο και καταγράφηκε η κινητοποίηση των ιόντων Ca2+ διαμέσου της πλασματικής μεμβράνης και της μεμβράνης του ΕΔ ως απόκριση στο KCl, την καρβαχόλη και τη θαψιγκαργκίνη, ενώ παράλληλα εξετάστηκε η μεσολαβούμενη από το γλουταμινικό οξύ ενεργοποίηση των Ca2+-εξαρτώμενων σηματοδοτικών μονοπατιών που επάγονται από τη διάνοιξη των υποδοχέων ΑΜΡΑ. Παρατηρήθηκε ότι, η υπερέκφραση του miR-124 σε φυσιολογικές συνθήκες προκαλεί μείωση στο εκπολωτικό δυναμικό των κυττάρων SK-N-SH ως απόκριση στο KCl ή την καρβαχόλη και παρεμποδίζει τη μεσολαβούμενη από το γλουταμινικό οξύ ταχεία ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μορίων ΕRK1/2 και CaMKII, γεγονός που υποστηρίζει ότι το miR-124 δύναται να ρυθμίζει τη νευρωνική διαβίβαση και διεγερσιμότητα και επομένως τη συνολική συναπτική ισχύ. Συνεπώς, κρίθηκε απαραίτητο να διερευνηθεί ο πιθανός προστατευτικός ρόλος του miR-124 στη μεσολαβούμενη από το γλουταμινικό οξύ διεγερσιμοτοξικότητα. Διαπιστώθηκε ότι, η παρατεταμένη επίδραση με γλουταμινικό οξύ προκαλεί αύξηση στα ενδογενή επίπεδα έκφρασης του miR-124 και των GluR2-4 ισομορφών, με αποτέλεσμα την υπερδιέγερση των κυττάρων και την υπερενεργοποίηση των Ca2+-εξαρτώμενων σηματοδοτικών μονοπατιών που επάγονται από τη δράση των υποδοχέων ΑΜΡΑ. Τα γεγονότα αυτά οδηγούν τελικά στη συσσώρευση των ιόντων Ca2+ στο κυτταρόπλασμα και τον αυλό του ΕΔ, την ενεργοποίηση του αποπτωτικού μονοπατιού των κασπασών και την επακόλουθη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Αντιθέτως, το miR-124 περιορίζει την υπερδιεγερσιμότητα των κυττάρων καθώς μειώνει σημαντικά την εισροή των ιόντων Ca2+ ως απόκριση στο KCl ή την εκροή τους από το ΕΔ ως απόκριση στην καρβαχόλη. Παράλληλα ασκεί νευροπροστατευτική δράση καθώς αποκαθιστά την ομοιόσταση των ιόντων Ca2+ τόσο στο κυτταρόπλασμα όσο και στο ΕΔ και καταστέλλει την ενεργοποίηση των κασπασών 9 και 3, προάγοντας την κυτταρική βιωσιμότητα. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν ότι, το miR-124 προστατεύει τα κύτταρα από τις βλαβερές συνέπειες της διεγερσιμοτοξικότητας.
Όσον αφορά την περίπτωση των υποδοχέων RyR και IP3R, αρχικά εξετάστηκε η συμμετοχή των miR-124 και miR-153 στη μεσολαβούμενη από αυτούς τους υποδοχείς απελευθέρωση των ιόντων Ca2+ από το ΕΔ στο κυτταρόπλασμα, καθώς και στο περιεχόμενο του ΕΔ σε ιόντα Ca2+. Χρησιμοποιώντας τη φθορισμομετρική μέθοδο της απεικόνισης των ιόντων Ca2+ σε πραγματικό χρόνο αποκαλύφθηκε ότι, η κινητοποίηση των ιόντων Ca2+ από τον αυλό του ΕΔ ως απόκριση στην καρβαχόλη και καφεΐνη, τους δύο κύριους αγωνιστές των υποδοχέων IP3R και RyR, είναι σημαντικά μειωμένη παρουσία των miR-124 και miR-153, ενώ τόσο τα βασικά επίπεδα της [Ca2+]κυτ. όσο και το περιεχόμενο του ΕΔ σε Ca2+ δεν επηρεάζονται από τη δράση αυτών των miRNAs. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν ότι, σε φυσιολογικές συνθήκες τα miR-124 και miR-153 ασκούν αυστηρό έλεγχο στην ενδοκυτταρική ομοιόσταση των ιόντων Ca2+, ενώ διατηρούν την ικανότητα του ΕΔ να λειτουργεί ως πηγή ιόντων Ca2+ που είναι απαραίτητη για τη νευρωνική λειτουργία. Ακολούθως, διερευνήθηκε ο πιθανός νευροπροστατευτικός ρόλος των miR-124 και miR-153 σε συνθήκες στρες του ΕΔ που επάγονται από την παρατεταμένη επώαση των κυττάρων με καφεΐνη ή τουνικαμυκίνη. Παρατηρήθηκε ότι, η ενδογενής έκφραση των miR-124 και miR-153 μειώνεται σημαντικά, ενώ επάγεται η έκφραση των RyR1-3 mRNAs και IP3R1-3 mRNAs, υποδεικνύοντας την αλληλεξάρτηση των miRNAs και των υποδοχέων RyR και IP3R στη διατήρηση της ενδοκυτταρικής ομοιόστασης των ιόντων Ca2+ υπό συνθήκες στρες του ΕΔ. Η αντίστροφη συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης αυτών των miRNAs και mRNAs οδηγεί τελικά στην υπέρμετρη διαρροή των ιόντων Ca2+ από το ΕΔ και τη συσσώρευσή τους στο κυτταρόπλασμα, γεγονότα που παρεμποδίζονται από την υπερέκφραση των miR-124 και miR-153, με επακόλουθο την καταστολή της ενεργοποίησης του κλάδου PERK του βιοχημικού μονοπατιού απόκρισης των μη αναδιπλωμένων πρωτεϊνών, UPR (Unfolded Protein Response). Ως εκ τούτου, τα miR-124 και miR-153 ρυθμίζουν την ενδοκυτταρική ομοιόσταση των ιόντων Ca2+ και ασκούν με τον τρόπο αυτό νευροπροστατευτική δράση στους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν το στρες του ΕΔ.
Συγκεντρωτικά, τα δεδομένα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αναδεικνύουν τον κρίσιμο ρόλο των νευρωνικών miRNAs στη ρύθμιση της έκφρασης συγκεκριμένων ιοντικών διαύλων που συντονίζουν τη νευρωνική λειτουργία. Σημαντικότερο εύρημα είναι ότι, κυρίαρχο ρόλο διαδραματίζει το miR-124, καθώς μεταβάλλει την έκφραση τόσο των διαύλων TREK και των υποδοχέων AMPA, όσο και των υποδοχέων RyR και IP3R και για τον λόγο αυτό αναδεικνύεται ως ένας κύριος ρυθμιστής της διεγερσιμότητας των νευρικών κυττάρων. Η ουσιαστική συμβολή των miRNAs στη ρύθμιση της σηματοδότησης που συντονίζει τη διακίνηση των ιόντων από και προς τα διάφορα κυτταρικά διαμερίσματα διευρύνει τις γνώσεις μας όσον αφορά τις λειτουργίες τους σε διάφορες νευρωνικές διεργασίες, αλλά και την αλληλεξάρτησή τους με την παθογένεια των νευρολογικών διαταραχών. Δεδομένου ότι ένας αριθμός miRNAs έχει ήδη εγκριθεί για χρήση σε προκλινικές μελέτες για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών, περαιτέρω μελέτες δύναται να αναδείξουν την πιθανή χρήση αυτών των miRNAs ως βιοδείκτες ή φαρμακευτικούς στόχους για τη διάγνωση και θεραπεία πληθώρας νευροπαθολογικών καταστάσεων.
