Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Εμμανουήλ Μικρός Καθηγητής Τμήμα Φαρμακευτικής ΕΚΠΑ,
Α. Παπαπετρόπουλος Καθηγητής Τμήμα Φαρμακευτικής ΕΚΠΑ,
Ι. Κ. Κωστάκης Αναπλ. Καθηγητής Τμήμα Φαρμακευτικής ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Το υδρόθειο (H2S), ένα άχρωμο αέριο χαρακτηριστικά δύσοσμο, είναι γνωστό από το 1713. Για πολλά χρόνια μελέτες διεξάγονταν αποκλειστικά για την τοξικότητά του, ώσπου ανακαλύφθηκε η ενδογενής παραγωγή του στα θηλαστικά. Η ανακάλυψη αυτή, ώθησε την επιστημονική κοινότητα στη διερεύνηση της λειτουργίας του και την εμπλοκή του στα διάφορα συστήματα του οργανισμού. Πλέον αναγνωρίζεται ως ο τρίτος αέριος διαβιβαστής μαζί με το μονοξείδιου του αζώτου (NO) και το μονοξείδιο του άνθρακα (CO). Είναι δηλαδή ένα ενζυματικά ενδογενώς παραγόμενο αέριο, ελεύθερο να διαπερνά τις κυτταρικές μεμβράνες και να εμπλέκεται με ποικίλους κυτταρικούς στόχους. Η γ-λυάση της κυσταθειονίνης (cystathionine γ-lyase, CSE) αποτελεί ένα από τα τρία ένζυμα του ανθρώπινου οργανισμού που είναι υπεύθυνα για την βιοσύνθεση του υδροθείου. Τα άλλα δύο είναι η β-συνθετάση της κυσταθειονίνης (cystathionine β-synthase, CBS) και η σουλφοτρανσφεράση του 3-μερκαπτοπυροσταφυλικού (3-mercaptopyruvate sulphurtransferase, 3MST). Βασικό υπόστρωμα του ενζύμου CSE για την παραγωγή του υδροθείου στον ανθρώπινο οργανισμό είναι η L-Κυστεΐνη (L-Cysteine), ενώ για την επιτέλεση της ενζυμικής αντίδρασης, είναι απαραίτητος ο συμπαράγοντας φωσφορική πυριδοξάλη (pyridoxal-5’-phosphate, PLP). Το σύστημα CSE/H2S εμπλέκεται σε μία πληθώρα σηματοδοτικών μονοπατιών στη φυσιολογία και παθοφυσιολογία του ανθρώπινου οργανισμού, καθιστώντας το CSE έναν πιθανό φαρμακολογικό στόχο. Το υδρόθειο χαρακτηρίζεται από τη διττή του φύση. Ανάλογα με το σύστημα που εξετάζεται, μεγαλύτερη συγκέντρωση ή μικρότερη συγκέντρωση από την επιθυμητή έχει συνδεθεί με παθοφυσιολογικές καταστάσεις. Για το λόγο αυτό, κρίνεται αναγκαία η ανάπτυξη τόσο αναστολέων, όσο αγωνιστών του ενζύμου. Ελάχιστα μόρια είναι διαθέσιμα στη βιβλιογραφία που να αποτελούν εκλεκτικά και ισχυρά δραστικά μόρια που να ενεργοποιούν ή να αναστέλλουν το ένζυμο CSE. Στόχος της παρούσας εργασίας αποτελεί η εύρεση τέτοιων ενώσεων.
Για την επίτευξη αυτού του σκοπού συνδυάστηκαν in vitro και in silico τεχνικές. Η χημική βιβλιοθήκη του τμήματος Φαρμακευτικής του ΕΚΠΑ, αποτελείται από περίπου 2000 ενώσεις. Σε αυτές περιλαμβάνονται φυσικά προϊόντα και συνθετικά ανάλογα. Ως πρώτο βήμα της παρούσας εργασίας, πραγματοποιήθηκε in vitro αξιολόγηση περίπου 470 συνθετικών ενώσεων έναντι του ενζύμου CSE. Για τα πειράματα αυτά, χρησιμοποιήθηκε η αναλυτική χρωματομετρική μέθοδος Methylene Blue assay με ένζυμο CSE με προσδέτη TAG (Glutathione-S-Transferase) το οποίο υπερεκφράστηκε, απομονώθηκε και καθαρίστηκε. Από τις ενώσεις που αξιολογήθηκαν, δύο έδειξαν ενδιαφέρουσα δράση έναντι του ενζύμου. Ένα ανάλογο διβενζοφουρανίου παρουσίασε δοσοεξαρτώμενη ανασταλτική δράση και ένα τριμεθοξυβένζυλο παράγωγο αγωνιστική δράση. Οι δύο αυτές ενώσεις χρησιμοποιήθηκαν ως μόρια-οδηγοί για την εύρεση ενώσεων με παρόμοια χαρακτηριστικά, και ενδεχομένως ίδια δραστικότατα, μέσω in silico μεθοδολογιών. Αυτές μπορούν να χωριστούν σε δύο μέρη. Το πρώτο μέρος αφορά την εύρεση παρόμοιων ενώσεων με τις ενώσεις-οδηγούς, μέσω δισδιάστατου και τρισδιάστατου ελέγχου ομοιότητας στη χημική βιβλιοθήκη της NCI. Το δεύτερο μέρος περιλαμβάνει τον έλεγχο της συγγένειας πρόσδεσης στο μοριακό στόχο, το ένζυμο CSE. Τα αποτελέσματα αυτά συνδυάστηκαν μέσω μίας μεθόδου consensus, για να προκύψουν τελικά 39 μόρια με υποψήφια δραστικότητα. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε μία προσπάθεια οργανικής σύνθεσης τριών αναλόγων του τριμεθοξυβένζυλο παραγώγου με μικρές διαμορφωτικές αλλαγές. Οι ενώσεις που προέκυψαν από τις υπολογιστικές μεθόδους καθώς και από την οργανική σύνθεση, αξιολογήθηκαν in vitro, χωρίς όμως να αποφέρουν κάποιο αξιοσημείωτο αποτέλεσμα.
Λέξεις-κλειδιά:
Υδρόθειο, Κυσταθειονίνη γ-λυάση, In vitro αξιολόγηση ενώσεων, In silico αξιολόγηση ενώσεων
