Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Σκορίλας Ανδρέας (Επιβλέπων), Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.
Βασιλακοπούλου Διδώ, Αναπλ. Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.
Τρουγκάκος Ιωάννης, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.
Σίδερης Διαμάντης, Αναπλ. Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.
Κοντός Χρήστος, Επικ. Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.
Ζωιδάκης Ιερώνυμος, Επικ. Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.
Αυγέρης Μαργαρίτης, Αναπλ. Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Ε.Κ.Π.Α.
Περίληψη:
O καρκίνος του παχέος εντέρου και του ορθού (ΚΠΕ-Ο) αποτελεί τη δεύτερη αιτία θανάτων σχετιζόμενων με καρκίνο παγκοσμίως. Μέχρι το έτος 2030 οι νέες διαγνώσεις όσο και οι θάνατοι αναμένεται να αυξηθούν έως και 30% σύμφωνα με το παρατηρητήριο του παγκόσμιου οργανισμού υγείας (ΠΟΥ). Η ανάπτυξη καρκινικών όγκων στο παχύ έντερο αποτελεί μία πολυσταδιακή διαδικασία συσσώρευσης γενετικών ή/και επιγενετικών τροποποιήσεων οι οποίες προωθούν ενδιάμεσες καλοήθεις νεοπλασίες με τη μορφή αδενωμάτων και αδενωματωδών πολυπόδων, επί των οποίων αναπτύσσεται η πλειοψηφία των κακοήθων όγκων στο παχύ έντερο.
Ο ΚΠΕ-Ο χαρακτηρίζεται από έντονη ετερογένεια με αποτέλεσμα να αποτελεί σημαντική κλινική πρόκληση η εκτίμηση της επιβίωσης αλλά και ο κίνδυνος υποτροπής των ασθενών. Το γεγονός αυτό οδηγεί σε αύξηση των φαινομένων υπό- και υπερθεραπείας (undertreatment, overtreatment). Συνεπώς η μελέτη του μοριακού προτύπου των όγκων παχέος εντέρου αποτελεί επιτακτική ανάγκη στην διαδικασία ταυτοποίησης νέων βιοδεικτών καρκίνου για τη συγκεκριμένη νόσο, οι οποίοι θα συμβάλουν στην εξατομικευμένη θεραπεία των ασθενών.
Αρχικά, στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής μελετήθηκε το μεταγραφωμικό πρότυπο καθιερωμένων βιοδεικτών καρκίνου και πιο συγκεκριμένα των βασικών πρώτο-ογκογονιδίων της οικογένειας RAS (KRAS, NRAS, HRAS) σε ένα ευρύ φάσμα ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών, αξιοποιώντας τη μεθοδολογία αλληλούχησης 3ης γενιάς και συγκεκριμένα τη μέθοδο αλληλούχησης μέσω νανοπόρου. Τα συγκεκριμένα γονίδια κωδικοποιούν τις αντίστοιχες RAS πρωτεΐνες οι οποίες ανήκουν στην οικογένεια των μικρών G πρωτεϊνών και συμμετέχουν σε πολλαπλά ενδοκυτταρικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος. Στις ανθρώπινες κακοήθειες εντοπίζονται διαρκώς ενεργοποιημένες κυρίως εξαιτίας σημειακών μεταλλαγών ή/και φαινομένων γονιδιακής ενίσχυσης. Σε ποσοστό περίπου 50% των ΚΠΕ-Ο εντοπίζεται μεταλλαγμένo το γονίδιο KRAS και σε μικρότερο ποσοστό τα NRAS και HRAS. Εκτός από τον καθοριστικό τους ρόλο στην ανάπτυξη του ΚΠΕ-Ο, η παρουσία μεταλλαγμένων RAS πρωτεϊνών αποτελεί ένα δυσμενή προβλεπτικό δείκτη για ανταπόκριση σε θεραπευτικά σχήματα με μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (epidermal growth factor receptor, EGFR), όπως τα cetuximab και panitumumab. Για το λόγο αυτό ο εντοπισμός νέων εναλλακτικών mRNA μεταγράφων των RAS γονιδίων ενδέχεται να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων βιολογικών λειτουργιών των συγκεκριμένων μεταγράφων καθώς και νέων υποψήφιων πρωτεϊνικών ισομορφών, ορισμένες εκ των οποίων ενδέχεται να αποτελούν μοριακούς δείκτες για τον ΚΠΕ-Ο. Συνολικά ανακαλύφθηκαν 39 νέα εναλλακτικά RAS mRNA μετάγραφα ενώ εκτιμήθηκε το πρότυπο έκφρασης τους μεταξύ των διαφορετικών ανθρώπινων κυτταρικών σειρών.
Στη συνέχεια έγινε προσπάθεια ταυτοποίησης νέων μικρών μη-κωδικών RNA (sncRNA) και πιο συγκεκριμένα miRNA και θραυσμάτων RNA προερχόμενα από tRNA (tRNA-derived RNA fragments, tRFs) ως πιθανοί διαγνωστικοί ή/και προγνωστικοί μοριακοί δείκτες για το ΚΠΕ-Ο. Είναι πλέον καλά τεκμηριωμένο στη διεθνή βιβλιογραφία ότι αρκετές κατηγορίες sncRNA μορίων εμπλέκονται καθοριστικά στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε μετά-μεταγραφικό επίπεδο με αποτέλεσμα να προωθούν την ανάπτυξη καρκινικών όγκων είτε να διαθέτουν ογκοκατασταλτικό ρόλο. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκε το πρότυπο έκφρασης των miRNA και tRF χρησιμοποιώντας δεδομένα αλληλούχησης νέας γενιάς (next-generation sequencing, NGS) προερχόμενα από ιστολογικά δείγματα ασθενών με ΚΠΕ-Ο και φυσιολογικών μαρτύρων. Η σύγκριση των διαφορετικών προτύπων έκφρασης των miRNA και tRF μεταξύ των διαφορετικών καταστάσεων, ανέδειξε sncRNA μόρια με σημαντικά διαφοροποιημένα επίπεδα έκφρασης. Ακολούθησε ο ακριβής προσδιορισμός της έκφρασης και η εκτενής κλινική αξιολόγηση της διαγνωστικής ή/και προγνωστικής αξίας για τα ορισμένα sncRNA μόρια στο ΚΠΕ-Ο.
Το miR-28-5p μπορεί να λειτουργεί είτε σαν ογκογόνο είτε σαν ογκοκατασταλτικό miRNA ενώ έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την επιθήλιο-μεσεγχυματική μετάπτωση και τελικά την μετάσταση. Η ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του miR-28-5p σε συνολικά 182 ιστολογικά δείγματα ΚΠΕ-Ο καθώς και 86 παρακείμενα του όγκου, μη-καρκινικά ιστοτεμάχια ανέδειξε ότι το miR-28-5p εκφράζεται σε χαμηλότερα επίπεδα στους καρκινικούς όγκους (p=0,005). Ωστόσο, κατά την ανάλυση επιβίωσης προέκυψε ότι τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του miR-28-5p σχετίζονται με μειωμένη ολική και ελευθέρας νόσου επιβίωση των ασθενών με KΠΕ-Ο (p=0,003 και στις δύο περιπτώσεις αντίστοιχα). Επιπλέον, η πολυμεταβλητή ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox ανέδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα σχετικής έκφρασης του miR-28-5p αποτελούν έναν σημαντικό δυσμενή προγνωστικό δείκτη της ολικής (p=0,016) και ελευθέρας νόσου επιβίωσης (p=0,002) στο ΚΠΕ-Ο, ανεξάρτητο από τους ήδη καθιερωμένους όπως το μέγεθος του όγκου, το στάδιο του όγκου κατά TNM, το βαθμό διαφοροποίησης του όγκου και τη λήψη ράδιο- ή/και χημειοθεραπείας. Τέλος, τα υψηλά επίπεδα έκφρασης του miR-28-5p, σχετίζονται με αυξημένη πιθανότητα υποτροπής της νόσου μεταξύ των ασθενών στους οποίους κατά τη διάγνωση δεν υπάρχει διήθηση των επιχώριων λεμφαδένων (N0) (p=0,020), καθώς και με μειωμένη ολική επιβίωση των ασθενών με μη-μεταστατικό ΚΠΕ-Ο (p=0,011).
Χρησιμοποιώντας την ίδια ομάδα ασθενών πραγματοποιήθηκε ποσοτική ανάλυση της έκφρασης και αξιολόγηση της διαφοροδιαγνωστικής και προγνωστικής αξίας των επιπέδων σχετικής έκφρασης του miR-15a-5p στο ΚΠΕ-Ο. Το miR-15a-5p έχει διαπιστωθεί ότι προωθεί τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη χημειοανθεκτικότητα των κυττάρων παχέος εντέρου μέσω της ρύθμισης των μονοπατιών των σηματοδοτικών μονοπατιών STAT3/TWIST1 και PTEN/AKT. Κατά την ποσοτική ανάλυση της έκφρασης του miR-15a-5p διαπιστώθηκε σημαντικά αυξημένη έκφραση σε καρκινικά ιστολογικά δείγματα σε σχέση με το παρακείμενο μη-καρκινικό ιστό (p=0,003). Επιπλέον, η ικανότητα τον επιπέδων έκφρασης miR-15a-5p διακρίνουν τους καρκινικούς όγκους αναδείχθηκε τόσο από την ανάλυση ROC (AUC = 0.61, 95% CI 0.54–0.68, p=0.003) όσο και από τη μονομεταβλητή ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης παλινδρόμησης (OR=1.50, 95% CI=1.14–1.97, p=0.004). Τα υψηλά επίπεδα σχετικής έκφρασης του miR-15a-5p αποτελούν δυσμενή προγνωστικό δείκτη τόσο για την επιβίωση ελευθέρας νόσου (p=0,001) καθώς και ολική επιβίωση (p=0,035) των ασθενών με ΚΠΕ-Ο. Τα μοντέλα πολυμεταβλητής ανάλυσης κατά Cox ανέδειξαν την ανεξάρτητη των ήδη καθιερωμένων προγνωστικών παραμέτρων, κλινική αξία του miR-15a-5p στην εκτίμηση του σχετικού κινδύνου υποτροπής των ασθενών με ΚΠΕ-Ο (HR=5.40, 95% CI=1.93–15.09, p=0.001). Τέλος, ο δυσμενής προγνωστικός χαρακτήρας της υψηλής έκφρασης του miR-15a-5p διατηρείται και στις ομάδες των μη μεταστατικών ασθενών (M0) κατά τη στιγμή της αρχικής διάγνωσης καθώς και των T3 ασθενών. Οι μη μεταστατικοί ασθενείς που εκφράζουν σε υψηλά επίπεδα το miR-15a-5p εμφανίζουν μικρότερη ολική επιβίωση (OS) (p=0,022). Οι ασθενείς με τοπικά προχωρημένη νόσο που υπερεκφράζουν το miR-15a-5p παρουσιάζονται με μειωμένη ολική (OS) (p<0,001) αλλά και ελευθέρας νόσου επιβίωση (DFS) (p=0,003). Ιδιαίτερο ενδιαφέρον αποτελεί η παρατήρηση ότι ασθενείς χαμηλού TNM σταδίου (ΤΝΜ I/II) οι οποίοι υπερεκφράζουν το miR-15a-5p παρουσιάζουν σημαντικά μειωμένη ελευθέρας νόσου επιβίωση (DFS) (p=0,004).
Στη συνέχεια, ελέγχθηκε η διαφοροδιαγνωστική και προγνωστική αξία του θραύσματος tRNA 5′-tiRNA-ProTGG χρησιμοποιώντας 155 καρκινικά και 74 μη-καρκινικά ιστολογικά δείγματα παχέος εντέρου. Καθώς τα RNA θραύσματα προερχόμενα από tRNA (tRF) αποτελούν μία μεταβλητή ομάδα sncRNA μορίων, αναπτύχθηκαν εξειδικευμένα πρωτόκολλα ποσοτικού προσδιορισμού για την ανάλυση της έκφρασής τους. H ποσοτική ανάλυση της έκφρασης για το 5′-tiRNA-ProTGG ανέδειξε μειωμένη έκφρασή του στα καρκινικά ιστολογικά δείγματα σε σχέση με το παρακείμενο μη-καρκινικό ιστό (p<0,001). Επιπροσθέτως, διαπιστώθηκε μέσω ανάλυσης καμπυλών Kaplan-Meier ότι τα υψηλά επίπεδα σχετικής έκφρασης του 5′-tiRNA-ProTGG αποτελούν δυσμενή προγνωστικό δείκτη στο ΚΠΕ-Ο όσον αφορά τόσο την ελευθέρας νόσου (p=0,021) όσο και την ολική επιβίωση των ασθενών (p=0,036). Ο δυσμενής προγνωστικός χαρακτήρας των υψηλών επιπέδων έκφρασης 5′-tiRNA-ProTGG για την επιβίωση των ασθενών διατηρείται τόσο σε εκείνους που χαρακτηρίζονται από όγκους παχέος εντέρου μέτριας διαφοροποίησης (Grade II) καθώς και σε αυτούς των οποίων ο όγκος εντοπίζεται στο ορθό. Σύμφωνα με το μοντέλο της πολυμεταβλητής ανάλυσης κατά Cox, τα υψηλά επίπεδα σχετικής έκφρασης 5′-tiRNA-ProTGG αποτελούν έναν ανεξάρτητο, δυσμενή προγνωστικό δείκτη πρόβλεψης της υποτροπής στο ΚΠΕ-Ο (HR=1.94, 95% CI=1.14–3.32, p=0.024). Τέλος, η λειτουργική ανάλυση του 5′-tiRNA-ProTGG μέσω υπολογιστικών εργαλείων ανέδειξε τη πιθανή εμπλοκή του συγκεκριμένου μορίου στη ρύθμιση σημαντικών σηματοδοτικών μονοπατιών τα οποία εμπλέκονται στην ανάπτυξη ΚΠΕ-Ο, όπως τα MAPK, MTOR και PD-1/PD-L1.
