Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Γεωργοπούλου Ουρανία, Διευθύντρια Ερευνών, Ερηαστήριο Μοριακής Ιολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Διαλλινάς Γεώργιος, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Κοσκίνας Ιωάννης, Καθηγητής, Τμήμα ιατρικής, ΕΚΠΑ
Παπαζαφείρη Παναγιώτα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Στραβοπόδης Δημήτριος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Τσιτσιλώνη Ουρανία, Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Φωκά Πελαγία, Κύρια Ερευνήτρια, Εργαστήριο Μοριακής Ιολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Περίληψη:
Η λοίμωξη από τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) αποτελεί σήμερα μια από τις κυριότερες αιτίες χρόνιας ηπατίτιδας, κίρρωσης και ηπατοκυτταρικού καρκίνου (ΗΚΚ), ενώ ο καρκίνος του ήπατος αποτελεί έναν από τους πιο θανατηφόρους καρκίνους. Κάθε χρόνο σημειώνονται 1.5 εκατομμύρια νέα περιστατικά ηπατίτιδας C, ενώ όπως υπολογίστηκε για το 2022, απαριθμούνται περίπου 58 εκατομμύρια φορείς του ιού παγκοσμίως. Επιπλέον, μόνο το 2019 σημειώθηκαν 290.000 θάνατοι ασθενών με ηπατίτιδα C. Οι αιτίες θανάτου ήταν η κίρρωση και ο ΗΚΚ. Παρόλο που τα αντιιικά άμεσης δράσης θεραπεύουν αποτελεσματικά ποσοστό άνω του 95% των ασθενών, ο κίνδυνος ανάπτυξης ΗΚΚ παραμένει αυξημένος, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις ασθενών με υπόβαθρο ίνωσης και κίρρωσης, κυρίως λόγω των επιγενετικών αλλαγών στο κύτταρο που προκαλούν με τη δράση τους οι ιικές πρωτεΐνες και οδηγούν σε χρόνια νόσο που περιλαμβάνει στεάτωση, φλεγμονή και ίνωση. Δεδομένης της αργής εξέλιξης της ηπατικής νόσου, καθώς και της απουσίας συμπτωμάτων για πολλά χρόνια μετά τη λοίμωξη, καθίσταται επιτακτική η ανάγκη αποσαφήνισης των, άγνωστων μέχρι σήμερα, επιγενετικών μηχανισμών που επάγονται από τον HCV και οδηγούν σε χρόνια νόσο, συμβάλλοντας έτσι στη στόχευση νέων μονοπατιών με σκοπό την έγκαιρη θεραπεία ή την πρόληψη. Τέλος, οι κυτταρικοί παράγοντες που καθορίζουν την εξέλιξη της HCV μόλυνσης παραμένουν άγνωστοι, κυρίως επειδή οι φορείς σπάνια ελέγχονται κατά την έναρξη της μόλυνσης, λόγω της απουσίας συμπτωμάτων, αλλά και λόγω της ετερογένειας των πολλών ιικών στελεχών που δυσχεραίνει την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων.Ο HCV, προκειμένου να χρησιμοποιήσει το κύτταρο-ξενιστή ως εργοστάσιο για την αναπαραγωγή του, στρατολογεί τις πρωτεΐνες του με σκοπό τη μεταβολή της κυτταρικής φυσιολογίας και τη δημιουργία ενός περιβάλλοντος ευνοϊκού για τον ιικό αναδιπλασιασμό. Μια ομάδα επιγενετικών παραγόντων που ρυθμίζει πολλές κυτταρικές λειτουργίες και θα μπορούσε να μεσολαβήσει στις αλλαγές της κυτταρικής λειτουργίας προς όφελος της αναπαραγωγής του HCV αποτελείται από τις ειδικές για τη λυσίνη απομεθυλάσες 1 και 2 (lysine-specific demethylase 1 και 2, LSD1 και LSD2), οι οποίες δρουν απομεθυλιώνοντας μεθυλιωμένα κατάλοιπα λυσίνης. Μέσω της απομεθυλίωσης των ιστονών ρυθμίζουν επιγενετικά την έκφραση γονιδίων, ενώ στοχεύουν και μη ιστονικές πρωτεΐνες, όπως για παράδειγμα την p53, μεταβάλλοντας μετα-μεταφραστικά τη δράση τους. Διαταραχές στη φυσιολογική έκφραση και την ενζυμική ενεργότητα της LSD1 έχουν συνδεθεί με διάφορους τύπους καρκίνου, μεταξύ αυτών και του ΗΚΚ. Τα τελευταία χρόνια διερευνήθηκε έντονα η συμμετοχή της LSD1 στην επιτυχή εγκαθίδρυση μολύνσεων από διάφορους ιούς, όπως ο ιός του απλού έρπητα τύπου 1, ο ιός της ηπατίτιδας Β αλλά και στην αναστολή άλλων, όπως ο ιός της φυσαλιδώδους στοματίτιδας ή ο ιός της γρίπης τύπου Α. H LSD2, ομόλογη πρωτεΐνη της LSD1, παρότι έχει μελετηθεί σε πολύ μικρότερο βαθμό, φαίνεται πως συμμετέχει στον λιπιδικό μεταβολισμό των ηπατοκυττάρων και στον έλεγχο της μεταγραφής, καθώς και σε μονοπάτια καρκινογένεσης. Μέχρι σήμερα δεν έχει συσχετιστεί με τις ιικές μολύνσεις.Με βάση όλα τα παραπάνω, πρώτος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η καταγραφή των ενδογενών επιπέδων των LSDs κατά την HCV μόλυνση και η συσχέτισή τους με βασικές κυτταρικές λειτουργίες που συμμετέχουν και που θα μπορούσαν να εξηγήσουν δυσμενείς διαταραχές του κυτταρικού φαινοτύπου. Παράλληλα, τέθηκε ως στόχος και η διερεύνηση του πιθανού ρόλου των δύο μορίων στην εξέλιξη της ίδιας της μόλυνσης, καθώς και οι μηχανισμοί που πιθανώς συμμετέχουν. Επιπρόσθετα, έχει αναφερθεί πως ο HCV αυξάνει την έκφραση και την ενεργοποίηση των μεταλλοπρωτεϊνασών στρώματος (matrix metalloproteinases, MMPs), δηλαδή των πρωτεασών που διασπούν με πρωτεόλυση τα μόρια της εξωκυττάριας ουσίας. Η δράση των πρωτεϊνών αυτών ρυθμίζεται από κυτταροκίνες και προφλεγμονώδεις παράγοντες, όπως και από τον επαγωγέα μεταλλοπρωτεϊνασών εξωκυττάριας ουσίας (extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN), μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών, με ρόλους στην επικοινωνία, στη διαφοροποίηση, στην αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας και στο μεταβολισμό ενέργειας. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, η υπερέκφραση και η υπεργλυκοζυλίωση της EMMPRIN είναι άρρηκτα συνδεδεμένες με τη μετάσταση του ΗΚΚ. Σημειώνεται πως κατά τον ΗΚΚ συχνά παρουσιάζονται ενδοηπατικές μεταστάσεις που μειώνουν δραματικά την πρόγνωση των ασθενών. Επίσης, πολύ πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν πως οι μηχανισμοί που επάγουν μετάσταση δρουν πολύ νωρίτερα από τη χρονική στιγμή που αυτή διαπιστώνεται. Ιοί όπως ο HCV έχουν τη δυνατότητα να διεγείρουν την κίνηση των κυττάρων. Έτσι, ο δεύτερος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση ενός πιθανού άξονα LSD1-EMMPRIN-MMPs και η συμβολή του στην εξέλιξη του HCV-επαγόμενου μεταστατικού καρκίνου. Κατά την πειραματική διαδικασία χρησιμοποιήθηκε η ηπατική κυτταρική σειρά Huh7.5, η μοναδική ως σήμερα που μπορεί να υποστηρίξει τον πλήρη κύκλο ζωής του HCV, καθώς και ιικά υπο-στελέχη που παρασκευάστηκαν με βάση την αλληλουχία των στελεχών HCV-2a και -3a, τα οποία παρουσιάζουν διακριτές διαφορές στη λειτουργία, στην κινητική αναδιπλασιασμού τους αλλά και στις επιπτώσεις τους στον κυτταρικό φαινότυπο. Για τη μελέτη του ρόλου των LSDs στην HCV μόλυνση πραγματοποιήθηκαν μολύνσεις με τον HCV σε συνθήκες υπερέκφρασης της κάθε μίας ξεχωριστά, καθώς και μείωσης της δράσης ή της έκφρασης της LSD1 με φαρμακολογικό αναστολέα δράσης, με RNA σίγηση και με έκφραση ελλειμματικής LSD1 αντίστοιχα. Όσον αφορά στην LSD2, φάνηκε πως η υπερέκφρασή της δεν είχε ιδιαίτερη επίδραση στην κινητική της μόλυνσης. Αντίθετα, διαπιστώθηκε πως ο ιικός αναδιπλασιασμός αυξάνεται σημαντικά κατά τη μείωση της LSD1, ενώ αντίθετα αναστέλλεται κατά την υπερέκφραση της, καταδεικνύοντας έναν αρνητικό ρόλο της LSD1 στην επιτυχή ιική μόλυνση. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν και σε τριπλές συγκαλλιέργειες ηπατοκυττάρων με κύτταρα του ηπατικού κολποειδούς. Από την άλλη, παρακάμπτοντας το στάδιο της εισόδου των ιοσωματίων σε συνθήκες υπερέκφρασης της LSD1, μέσω απευθείας διαμόλυνσης με το HCV RNA, δεν παρατηρείται αναστολή του ιικού αναδιπλασιασμού. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει πως η LSD1 εμπλέκεται στα πρώτα στάδια της εισόδου του HCV ιοσωματίου.Για τη διερεύνηση του μηχανισμού παρεμπόδισης της HCV μόλυνσης, μελετήθηκαν παράγοντες της εισόδου/ενδοκυττάρωσης, μεταξύ αυτών και η επαγόμενη από ιντερφερόνη διαμεμβρανική πρωτεΐνη 3 (interferon-induced transmembrane protein 3, IFITM3). Η πρωτεΐνη αυτή εντοπίζεται στη μεμβράνη των ενδοσωμάτων και των λυσοσωμάτων και συμμετέχει στην άμυνα έναντι ιών που ακολουθούν το μονοπάτι της ενδοκυττάρωσης, οδηγώντας τα νεοεισερχόμενα ιοσωμάτια προς αποικοδόμηση στα λυσοσώματα. Η αντιιική δράση της ενεργοποιείται μέσω απομεθυλίωσης του μονο-μεθυλιωμένου καταλοίπου Κ88 από την LSD1. Τα πειράματα που διεξήχθησαν στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, έδειξαν πως η έκφραση της IFITM3 αυξήθηκε από την HCV-μόλυνση, ανεξάρτητα από τα επίπεδα της LSD1, αναδεικνύοντας το ρόλο της ως συστατικό άμυνας έναντι του HCV. Μάλιστα, κατά την υπερέκφραση της LSD1, τα επίπεδα IFITM3 παρέμειναν αυξημένα ακόμη και 24 ώρες μετά τη μόλυνση. Επιπλέον, στις ίδιες συνθήκες, τα επίπεδα της ανενεργής IFITM3 ήταν μειωμένα, ωστόσο κατά την υπερέκφραση της LSD1 ήταν σχεδόν μηδενικά, υποδηλώνοντας αυξημένη αντιιική δράση της IFITM3.Η εξάρτηση του κύκλου ζωής του HCV από την ύπαρξη ενδοκυτταρικών λιπιδίων είναι πλέον αρκετά τεκμηριωμένη και συγκεκριμένα, απαιτείται η τροποποίηση του λιπιδικού μεταβολισμού προς τη δημιουργία ενός ενδοκυτταρικού περιβάλλοντος πλούσιου σε λιπίδια, που υποστηρίζει την αντιγραφή, αυτοσυγκρότηση και έκκρισή του από το κύτταρο. Πειράματα χρώσης και μέτρησης των λιποσταγονιδίων έδειξε δραματική μείωση του αριθμού τους κατά την υπερέκφραση της LSD1, ακόμη και μετά την HCV μόλυνση, υποδηλώνοντας την πιθανή παρεμπόδιση της συγκρότησης ιοσωματίων. Αναφορικά με τους μετέπειτα κύκλους ιικής μόλυνσης, αποδείξαμε ότι ο HCV οδηγεί σε προοδευτική συσσώρευση και υπεργλυκοζυλίωση της πρωτεΐνης EMMPRIN στο κύτταρο, πιθανότατα μέσω της διαρκούς και κυματοειδούς ρύθμισης της LSD1 κατά τη μακρόχρονη μόλυνση, η οποία ευνοεί την υπεργλυκοζυλίωση της EMMPRIN. Ο λόγος υψηλά/χαμηλά γλυκοζυλιωμένης EMMPRIN είναι σχετικός με την επαγωγή των MMPs. Στην παρούσα μελέτη διαπιστώσαμε πως η παραγωγή διαλυτών MMPs αυξάνεται από τις LSD1 και EMMPRIN, επιβεβαιώνοντας την ύπαρξη ενός άξονα LSD1-EMMPRIN-MMPs που θα μπορούσε να ενισχυθεί από την HCV μόλυνση επάγοντας προ-μεταστατικές διεργασίες.Συνολικά, στην παρούσα διατριβή αποσαφηνίστηκε για πρώτη φορά ο ρόλος της LSD1 στην HCV μόλυνση και ταυτοποιήθηκαν μηχανισμοί που προσδίδουν ανασταλτικό, για την HCV μόλυνση, χαρακτήρα στην LSD1, σε δύο διαφορετικά στάδια του ιικού κύκλου. Τέλος, βρέθηκε ότι η LSD1 συμμετέχει μέσω της EMMPRIN στην ανάπτυξη ενός προ-μεταστατικού μηχανισμού, που ίσως επάγεται από τον HCV. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν εφαλτήριο για τη λεπτομερέστερη μελέτη των μηχανισμών που συνδέουν την HCV μόλυνση με την εξέλιξη της χρόνιας ηπατικής νόσου και την επαγωγή και εξέλιξη ηπατοκαρκινογένεσης, καθώς και για τον εντοπισμό μονοπατιών-στόχων για την αποτελεσματικότερη πρόληψη και διαχείριση της HCV-επαγόμενης ηπατικής νόσου.
Λέξεις-κλειδιά:
επιγενετική, ιογενής ηπατίτιδα, ηπατίτιδα C, ηπατίτιδα Β, ιολογία, ηπατοκυτταρικός καρκίνος, καρκίνος ήπατος, μετάσταση, εξωκυττάρια μήτρα, μεταλλοπρωτεϊνάσες, LSD1, LSD2, EMMPRIN, ενδοσώματα, λυσοσώματα, επιγενετική υπογραφή, ηπατοκαρκινογένεση.
