Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Ελένη Ντότσικα (επιβλέπουσα): Διευθύντρια Ερευνών, Τομέας Μικροβιολογίας, Εργαστήριο Κυτταρικής Aνοσολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Λέανδρος- Αλέξιος Σκαλτσούνης: Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Ε.Κ.Π.Α.
Νεκτάριος Αληγιάννης: Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Ε.Κ.Π.Α.
Μαρία Χαλαμπαλάκη: Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Ε.Κ.Π.Α.
Σοφία Μητάκου: Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Ε.Κ.Π.Α.
Εμμανουήλ Αγγελάκης, Διευθυντής Ερευνών, Τομέας Μικροβιολογίας, Διαγνωστικό Τμήμα, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Δέσποινα Σμυρλή: Κύρια Ερευνήτρια, Τομέας Μικροβιολογίας, Εργαστήριο Μοριακής Παρασιτολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ
Περίληψη:
Τα φυτά ανέκαθεν αποτελούσαν πολύτιμη πηγή μορίων με φαρμακολογικές ιδιότητες. Οι πολυάριθμοι δευτερογενείς μεταβολίτες που διαθέτουν παρουσιάζουν ένα μεγάλο εύρος βιολογικών δράσεων μεταξύ των οποίων περιλαμβάνονται αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αντικαρκινικές και αντιμικροβιακές ιδιότητες. Το δέντρο της ελιάς (Olea europaea) συγκαταλέγεται μεταξύ των φυτών που έχουν μελετηθεί εκτενώς για φαρμακολογικές δράσεις. Η ικανότητα του εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου να προωθεί την ανθρώπινη υγεία διαμέσου του περιορισμού της οξείδωσης και της φλεγμονής που μπορούν να οδηγήσουν σε χρόνια εκφυλιστικά νοσήματα, έχει δειχθεί από έναν μεγάλο αριθμό πειραματικών και κλινικών μελετών. Οι ιδιότητες αυτές του ελαιολάδου το καθιστούν ένα από τα σημαντικότερα λεγόμενα «λειτουργικά τρόφιμα» και πλήθος ερευνητικών εργασιών είναι αφιερωμένες στη διαλεύκανση της βιοδραστικότητας των συστατικών του. Οι ευεργετικές επιδράσεις του οφείλονται κυρίως στο φαινολικό κλάσμα του, το οποίο περιέχει πάνω από 50 διαφορετικά φαινολικά μόρια. Η λεκάνη της Μεσογείου είναι μια περιοχή όπου το δέντρο της ελιάς ευδοκιμεί και το ελαιόλαδο αποτελεί ένα αναντικατάστατο συστατικό της Μεσογειακής διατροφής, η οποία συνδέεται αδιαμφισβήτητα με οφέλη στην ανθρώπινη υγεία.
H νόσος λεϊσμανίαση η οποία οφείλεται στα παράσιτα του γένους Leishmania spp. ενδημεί στην περιοχή της Μεσογείου, καθώς και σε άλλες τροπικές και υποτροπικές περιοχές του πλανήτη, όπως η Νότια Αμερική, η Μέση Ανατολή και η Κεντρική Ασία. Η μετάδοσή της πραγματοποιείται μέσω του δήγματος του ενδιάμεσου ξενιστή, της σκνίπας. Οι κυριότεροι τελικοί ξενιστές του παρασίτου είναι ο σκύλος που αποτελεί τη βασική δεξαμενή του παρασίτου, ο άνθρωπος, και τα τρωκτικά. Το αποτέλεσμα της λοίμωξης από το παράσιτο Leishmania spp. εξαρτάται κυρίως από την ανοσολογική ικανότητα που θα εκδηλώσει ο τελικός ξενιστής, καθώς η κυτταρική ανοσολογική απάντηση του Th1 τύπου σχετίζεται με την αντιμετώπιση του παρασίτου και την ίαση, ενώ η ανοσολογική απάντηση του Th2 τύπου σχετίζεται με την πρόοδο της νόσου. Καθώς δεν υπάρχει διαθέσιμο εμβόλιο για την πρόληψη της νόσου στον άνθρωπο, η αντιμετώπισή της βασίζεται σε έναν περιορισμένο αριθμό χημειοθεραπευτικών παραγόντων οι οποίοι εμφανίζουν σημαντικά μειονεκτήματα, όπως ανάπτυξη αντοχής του παρασίτου και τοξικότητα. Συνεπώς, η αναζήτηση νέων μορίων με αντιλεϊσμανιακή δράση είναι ουσιώδους σημασίας και το πεδίο των φυσικών προϊόντων μπορεί να αποτελέσει μια υποσχόμενη πηγή νέων φαρμάκων.
Ακολουθώντας αυτό το ερευνητικό μονοπάτι, η παρούσα διδακτορική διατριβή είχε ως στόχο να διερευνήσει την αντιλεϊσμανιακή και ανοσοτροποιητική δράση του ολικού φαινολικού κλάσματος (Total Phenolic Fraction, TPF) του εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου και του προερχόμενου από αυτό καθαρού μορίου της ολεοκανθάλης, σε in vitro και in vivo συστήματα.
Το TPF αποδείχτηκε δραστικό έναντι δύο διαφορετικών στελεχών του παρασίτου Leishmania spp., των L. infantum και L. major, τόσο στην προμαστιγωτή όσο και στην αμαστιγωτή μορφή τους, ενώ ως δείκτης της αποτελεσματικότητάς του προσδιορίστηκε η μέση ανασταλτική συγκέντρωση της επιβίωσης/πολλαπλασιασμού του παρασίτου (IC50). Επιπροσθέτως, η ερευνητική μελέτη επικεντρώθηκε στη διερεύνηση του τύπου του κυτταρικού θανάτου των προμαστιγωτών που επάγεται από τη δράση του TPF, μέσω του προσδιορισμού συγκεκριμένων μορφολογικών και βιοχημικών παραμέτρων που σχετίζονται με την απόπτωση.
Οι μορφολογικές αλλαγές που παρατηρήθηκαν μέσω οπτικής μικροσκοπίας ανέδειξαν την ικανότητα του TPF να προκαλεί συρρίκνωση του κυτταρικού σώματος, ενώ η μικροσκοπία φθορισμού ανέδειξε σημαντικές βλάβες στην ακεραιότητα του DNA τους. Η μελέτη των βιοχημικών τροποποιήσεων αποκάλυψε ότι το TPF είναι ικανό να προκαλεί κατακερματισμό του DNA των προμαστιγωτών Leishmania spp., αποδιοργάνωση της κυτταροπλασματικής τους μεμβράνης, διαταραχή του μιτοχονδριακού διαμεμβρανικού δυναμικού (ΔΨm) και εκσεσημασμένη παραγωγή ROS. Τα παραπάνω ευρήματα υποδήλωσαν την ικανότητα του TPF να προκαλεί αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο στους προμαστιγώτες Leishmania spp. Η υποσχόμενη αντιλεϊσμανιακή δράση του TPF όπως αναδείχθηκε από τα in vitro αποτελέσματα, οδήγησε την παρούσα μελέτη στην επέκταση της έρευνας σε in vivo πειραματικό μοντέλο δερματικής λεϊσμανίασης ποντικών, με σκοπό να διερευνηθεί η δράση του ως δυνητικό αντιλεϊσμανιακό φάρμακο. Ποντίκια της αιμομικτικής φυλής BALB/c μολύνθηκαν στο πέλμα με L. major προμαστιγώτες και τους χορηγήθηκε ως θεραπεία TPF. Το TPF προκάλεσε μείωση του φλεγμονώδους οιδήματος στο σημείο της μόλυνσης και σημαντική μείωση του παρασιτικού φορτίου στους ιγνυακούς λεμφαδένες. Επιπλέον, το TPF επέδειξε ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες προωθώντας την πόλωση της ανοσολογικής απόκρισης προς τον προστατευτικό τύπο της κυτταρομεσολαβητικής ανοσίας, επιτυγχάνοντας τον έλεγχο της νόσου. Ειδικότερα, διαπιστώθηκε η παραγωγή ειδικών αντιλεϊσμανιακών αντισωμάτων των IgG1 και IgG2a ισοτύπων, η οποία ήταν χαρακτηριστική της επαγωγής μικτής Th1 και Th2 απόκρισης με κυρίαρχο τον Th1 τύπο λεμφοκυττάρων. Αυτό επιβεβαιώθηκε από την αυξημένη παραγωγή της κυτταροκίνης IFN-γ, καθώς και από τη γονιδιακή έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων Tbx21 και GATA-3, που υπέδειξαν υπερίσχυση της Th1- τύπου απόκρισης.
Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση του TPF αποκάλυψε ότι ήταν πλούσιο στο φαινολικό μόριο της ολεοκανθάλης. Συνεπώς, ως επόμενος στόχος της μελέτης τέθηκε η διερεύνηση των πιθανών αντιλεϊσμανιακών ιδιοτήτων του καθαρού μορίου της ολεοκανθάλης έναντι των προμαστιγωτών και αμαστιγωτών μορφών των προαναφερθέντων παρασιτικών στελεχών, προκειμένου να προσδιοριστεί η μονήρης βιοδραστικότητά του κατά των παρασίτων Leishmania spp. Η ολεοκανθάλη συγκεντρώνει σημαντικό επιστημονικό ενδιαφέρον εξαιτίας των ισχυρών αντιφλεγμονωδών δράσεών της, που είναι συγκρίσιμες με αυτές της ιβουπροφαίνης, ενός μη στεροειδούς αντιφλεγμονώδους φαρμάκου. Επιπλέον, ανάμεσα στις δράσεις της συγκαταλέγονται και αντιοξειδωτικές και αντιμικροβιακές ιδιότητες. Η παρούσα μελέτη απέδειξε μια υποσχόμενη in vitro αντιλεϊσμανιακή δράση της ολεοκανθάλης η οποία επιβεβαιώθηκε και σε in vivo πειραματικά μοντέλα δερματικής και σπλαγχνικής λεϊσμανίασης. Στο πειραματικό μοντέλο της δερματικής λεϊσμανίασης, ποντικοί της αιμομικτικής φυλής BALB/c μολύνθηκαν με L. major προμαστιγώτες στο πέλμα και στη συνέχεια τους χορηγήθηκε ολεοκανθάλη σε δύο πειραματικές δοσολογίες. Η θεραπεία με ολεοκανθάλη μείωσε τις υποκείμενες βλάβες στο σημείο της μόλυνσης οδηγώντας σε μειωμένο φλεγμονώδες οίδημα και ταυτόχρονα προκάλεσε σημαντική μείωση του παρασιτικού φορτίου στους ιγνυακούς λεμφαδένες. Επιπλέον, τα πέλματα των ποντικών υποβλήθηκαν σε ιστοπαθολογική μελέτη που ανέδειξε την εκδήλωση τοπικής ανοσολογικής απόκρισης η οποία οδηγεί στην περιχαράκωση της μόλυνσης και στη στρατολόγηση κυττάρων της έμφυτης και προσαρμοστικής ανοσίας, όπως μακροφάγων, μαστοκυττάρων, Β- και T-κυττάρων, τα οποία συμβάλλουν στον έλεγχο της λοίμωξης. Επίσης, η ολεοκανθάλη προκάλεσε μεταβολή της παραγωγής των ειδικών αντιλεϊσμανιακών αντισωμάτων των IgG1 και IgG2a ισοτύπων με τρόπο που υποδεικνύει την επικράτηση της προστατευτικής Th1-τύπου απόκρισης. Επιπρόσθετα, αναδείχθηκε η ενισχυμένη παραγωγή της κυτταροκίνης IL-12 και η ενίσχυση των λόγων της γονιδιακής έκφρασης Tbx21/GATA-3 και IL-12/IL-4, που σχετίζονται με την πόλωση της ανοσολογικής απόκρισης προς τον Th1-τύπο, οδηγώντας στην αντιμετώπιση της νόσου. Στο αντίστοιχο πειραματικό μοντέλο της σπλαγχνικής λεϊσμανίασης, ποντικοί της αιμομικτικής φυλής BALB/c μολύνθηκαν ενδοφλεβίως με L. infantum προμαστιγώτες και στη συνέχεια τους χορηγήθηκε ολεοκανθάλη σε δύο πειραματικές δοσολογίες. Η ολεοκανθάλη προκάλεσε σημαντική μείωση του παρασιτικού φορτίου στο σπλήνα και στο ήπαρ που αποτελούν τα όργανα-στόχους του παρασίτου στη σπλαγχνική λεϊσμανίαση. Επίσης, η θεραπεία με ολεοκανθάλη οδήγησε σε αυξημένη παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου (NO) που αποτελεί βασικό λεϊσμανιοκτόνο μόριο. Ωστόσο, παρά τη μείωση στο παρασιτικό φορτίο και την επαγωγή του NO, η παραγωγή των αντισωμάτων IgG1 και IgG2a, η παραγωγή των κυτταροκινών (IL-12, IFN-γ και IL-4) και η γονιδιακή έκφραση συγκεκριμένων μεταγραφικών παραγόντων (Tbx-21, GATA-3, STAT-1 και STAT-4) δεν ανέδειξαν μια ξεκάθαρη επικράτηση της Th1-τύπου απόκρισης επί της Th2- τύπου.
Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής αναδεικνύουν ότι το TPF που προέρχεται από εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο, καθώς και το καθαρό μόριο της ολεοκανθάλης, έχουν την ικανότητα να δρουν ως αντιλεϊσμανιακοί και ανοσοτροποιητικοί φαρμακευτικοί παράγοντες. Αυτά τα υποσχόμενα επιστημονικά δεδομένα επισημαίνουν ότι υπάρχει ένα ανοιχτό πεδίο επιστημονικής έρευνας των φαινολών του εξαιρετικού παρθένου ελαιολάδου ως δυνητικών φαρμάκων έναντι λοιμωδών ασθενειών, καθώς και ως ανοσοτροποποιητικών παραγόντων που μπορούν να αξιοποιηθούν για τη ρύθμιση της ανοσίας προκειμένου να αντιμετωπιστούν σοβαρές ανθρώπινες ασθένειες.
Λέξεις-κλειδιά:
Φυσικά προϊόντα, Leishmania spp, Λεϊσμανίαση, Προμαστιγώτες, Αμαστιγώτες, Μεσογειακή Διατροφή, Εξαιρετικό Παρθένο Ελαιόλαδο, Ολικό Φαινολικό Κλάσμα, Ολεοκανθάλη, Απόπτωση, Ιστοπαθολογία, Ανοσολογική Απόκριση
