Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Χρήστος Κρούπης, Καθηγητής Ιατρικής Σχολή, ΕΚΠΑ,
Μουτσάτσου - Λαδικού Παρασκευή, Καθηγήτρια Ιατρικής Σχολή, ΕΚΠΑ,
Παπαγεωργίου Σωκράτης, Καθηγητής Ιατρικής Σχολή, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Ανίχνευση απλοτύπου Η1 στο ΜΑΡΤ γονίδιο σε βιολογικά υγρά ασθενών με άνοιες:
Εισαγωγή – Σκοπός: Η μετωποκροταφική άνοια (Frontotemporal Dementia, FTD) μπορεί να είναι είτε οικογενής (30-50%) είτε σποραδική και είναι το ίδιο συχνή με την νόσο Alzheimer’s σε άτομα ηλικίας <65 ετών. Μεταξύ των πολλών γονιδίων που ενέχονται στη νόσο είναι και το γονίδιο MAPT (microtubule – associated protein tau) το οποίο μεταγράφεται σε 3R/4R ισομορφές, αναλόγως εάν περιέχει τρεις ή τέσσερις επαναλήψεις των περιοχών δέσμευσης των μικροσωληνίσκων. Μεταλλάξεις στο γονίδιο MAPT ή διατάραξη της φυσιολογικής αναλογίας 1:1 των 3R/4R ισομορφών -και κατά συνέπεια της ισορροπίας των μικροσωληνίσκων των νευρικών κυττάρων- οδηγούν σε FTD. Σκοπός της εργασίας ήταν η ανάπτυξη μεθοδολογίας ανίχνευσης MAPT DNA παραλλαγών σε Έλληνες FTD ασθενείς με τις μεθοδολογίες DNA Sequencing και MLPA, η σύγκριση των αποτελεσμάτων με NGS συνεργαζόμενου εργαστηρίου και η αξιολόγηση των ευρημάτων σε FTD ασθενείς.
Υλικά και μέθοδοι: Αρχικά απομονώθηκε DNA με High Pure Template Kit (Roche) από περιφερικό αίμα 20 FTD Ελλήνων ασθενών, μετά από έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεσή τους. Πραγματοποιήθηκε σχεδιασμός ειδικών εκκινητών για την DNA ενίσχυση και αλληλούχιση 11 εξωνίων. Μετά την PCR ενίσχυση, ακολούθησε Cycle Sequencing (Big Dye Terminator v3.1) και ηλεκτροφόρηση των τελικών προϊόντων στον SeqStudio γενετικό αναλυτή (Thermo ABI). Επίσης, η MLPA μέθοδος πραγματοποιήθηκε για την ανίχνευση τυχόν μεγάλων DNA αναδιατάξεων (MRC Holland). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τα προγράμματα Chromas, NovoSNP και Coffalyzer.
Αποτελέσματα: Στη σύγκριση αποτελεσμάτων μεταξύ των δύο εργαστηρίων παρατηρήθηκε σχεδόν πλήρης ταύτιση. Στα 10 από τα 20 δείγματα, ανιχνεύθηκαν οι ίδιες 5 καλοήθεις παραλλαγές. Οι 2 από αυτές είναι ιντρονικές (rs75242405-rs1800547) και οι 3 είναι συνώνυμες εξωνικές (rs1052551-rs1052553-rs17652121). Οι τέσσερις από τους πέντε πολυμορφισμούς αποτελούν μέρος του απλοτύπου Η1.
Συμπεράσματα: Η επαλήθευση της αναπτυχθείσας μεθόδου για την ανίχνευση των ΜΑΡΤ παραλλαγών κρίνεται ικανοποιητική. Στο 50% των FTD ασθενών ανιχνεύθηκε ο MAPT Η1 απλότυπος ο οποίος συνδέεται με αυξημένη έκφραση της 4R ισομορφής η οποία δεσμεύεται πιο ισχυρά στους μικροσωληνίσκους. Η ανάλυση περισσότερων δειγμάτων FTD Ελλήνων ασθενών θα βοηθούσε ώστε να αποκαλυφθεί επακριβώς ο ρόλος του απλοτύπου Η1 στην ανάπτυξη υποτύπων της νόσου (π.χ. άτυπες παρκινσονικές μορφές).
Επαλήθευση μεθόδου μέτρησης βιοδεικτών σε βιολογικά υγρά ασθενών με άνοιες:
Εισαγωγή: Οι πρωτεΐνες του Εγκεφαλονωτιαίου Υγρού (ΕΝΥ), β-αμυλοειδές (αβ42), ολική tau και φωσφορυλιωμένη tau (p-tau181), αποτελούν σήμερα αξιόπιστους βιοδείκτες για την ανίχνευση αμυλοειδικών πλακών, νευροεκφυλισμού και συσσωματωμάτων tau πρωτεΐνης που οδηγούν σε νευροϊνιδιακά δεμάτια σύμφωνα με την ταξινόμηση AT(N) 2018 των νευροεκφυλιστικών ανοιών. Η αυτοματοποίηση τέτοιων ανοσοχημικών μετρήσεων θα οδηγήσει σε αύξηση της ακρίβειας των μεθόδων και της ευρύτερης χρήσης τους σε παγκόσμιο επίπεδο.
Υλικά και μέθοδοι: Συλλέχθησαν 27 δείγματα ΕΝΥ από ασθενείς που ανήκουν στο φάσμα του νευροεκφυλισμού (Νόσος Alzheimer, Μετωποκροταφική άνοια κτλ.) και αναλύθηκαν στη συνέχεια για τους ανωτέρω βιοδείκτες τόσο με τη μέθοδο αναφοράς ELISA (Innotest Fujirebio), όσο και με τα νέα CE-IVD αντιδραστήρια της Roche για τον αυτόματο αναλυτή Elecsys. Ένα δείγμα εξωτερικού ελέγχου ποιότητας, συμπεριλήφθηκε επίσης.
Αποτελέσματα: Οι νέες μέθοδοι της Roche, είναι εύκολες στην εφαρμογή τους, ταχείες (τα αποτελέσματα δίνονται μέσα σε 18 λεπτά σε σύγκριση με τις 20 ώρες της χειροκίνητης ELISA) και παρουσιάζουν εξαιρετικά αποτελέσματα πιστότητας (εξαιρετικά χαμηλός συντελεστής μεταβλητότητας τόσο στα χαμηλά όσο και στα υψηλά δείγματα ελέγχου CV% <5% σε σύγκριση με το 8-12% της ELISA). Στατιστικές αναλύσεις συσχέτισης (correlation), παλινδρόμησης (regression) και συμφωνίας (concordance) πραγματοποιήθηκαν για κάθε μία από τις παραμέτρους, από όπου προέκυψαν οι ακόλουθες εξισώσεις: α) αβ42Roche=1,18 x αβ42Fujirebio-94 (r=0,91, συμφωνία 70%), β) ολική tauRoche=0,65 x ολική tauFujirebio+7 (rho=0,87, συμφωνία 96%) και γ) p-tau181Roche=0,56 x p-tau181Fujirebio-9 (rho=0,93, συμφωνία 81%). Για να είναι δίκαιη η σύγκριση μεθόδων, ο διαχωρισμός του φυσιολογικού από το μη-φυσιολογικό αποτέλεσμα (normal/abnormal), πραγματοποιείται με τη βοήθεια των cut-offs ορίων της βιβλιογραφίας για τη
Fujirebio (550, 375, 52 pg/ml για αβ42, ολική tau και p-tau181 αντίστοιχα, αν και ο κατασκευαστής προτείνει και διαχωρισμό με βάση την ηλικία) και για τη Roche 800, 300, 27 pg/ml αντίστοιχα (προτεινόμενα από τη Roche εκτός του cut-off του αβ42, το οποίο αυθαίρετα μετατράπηκε από 1000 σε 800 pg/ml ώστε να βελτιωθεί η συμφωνία των δύο μεθόδων).
Συμπεράσματα: Οι δύο μέθοδοι παρέχουν στατιστικά σχετιζόμενα αποτελέσματα για τις παραμέτρους ολική tau και p-tau181× το cut-off που παρέχει η Roche για την ολική tau είναι κατάλληλο για τον διαχωρισμό των περιπτώσεων, ενώ το όριο της p-tau181 χρειάζεται μικρή βελτίωση για να αυξηθεί η συμφωνία των μεθόδων. Οι τιμές του αβ42, φαίνεται να συγκλίνουν στην αποδεκτή συσχέτιση και ισοδυναμία, παρόλα αυτά, η τιμή των ορίων και για τις δύο μεθόδους χρειάζεται επανεξέταση καθώς πρέπει να ληφθεί υπόψιν το νέο πιστοποιημένο υλικό αναφοράς. Παρόλα αυτά η τελική και ορθή ταξινόμηση των περιπτώσεων άνοιας με βάση τους βιοδείκτες ΕΝΥ θα πρέπει να γίνεται σε συνδυασμό με την κλινική εικόνα του ασθενούς και την παρακολούθησή τους. Επιβάλλεται η συνεχής προσπάθεια προς βελτίωση της μέτρησης αυτών των παραμέτρων, με σκοπό την τυποποίηση και εναρμόνιση των μεθόδων σε παγκόσμια κλίμακα.
Λέξεις-κλειδιά:
MAPT, απλότυπος Η1, βιοδείκτες, ΕΝΥ, αβ42, tau, p-tau
