Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Σίδερης Διαμάντης, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.
Ράμπιας Θεόδωρος, Ερευνητής Γ’, Κέντρο Βασικής Έρευνας, Ι.ΙΒ.Ε.Α.Α.
Αυγέρης Μαργαρίτης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Ε.Κ.Π.Α.
Περίληψη:
Το Πλακώδες Καρκίνωμα Κεφαλής και Τραχήλου (HNSCC) αποτελεί μία από τις συχνότερες αιτίες
θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως. Παρά την σοβαρότητα της νόσου η διάγνωση δεν είναι
αποτελεσματική λόγω της έλλειψης στρατηγικών διαλογής με αποτέλεσμα οι περισσότεροι ασθενείς να διαγιγνώσκονται σε προχωρημένα στάδια. Ο HNSCC αποτελεί μία ιδιαίτερα ετερογενή νόσο και η θεραπεία του απαιτεί επιθετικές προσεγγίσεις χειρουργικής επέμβασης και ακτινοθεραπείας με σοβαρές παρενέργειες και κακή ποιότητα ζωής για τους ασθενείς. Ως εκ τούτου είναι αναγκαίος ο άμεσος χαρακτηρισμός των μοριακών μονοπατιών που αφορούν τον HNSCC ώστε να καθιερωθεί αποτελεσματικότερη διάγνωση και θεραπεία. Η παρούσα εργασία επιχειρεί να διερευνήσει τα μοριακά μονοπάτια που χαρακτηρίζουν τον HNSCC μέσω της αξιολόγησης και κατηγοριοποίησης πλήθους δεδομένων ασθενών της βάσης TCGA, να αξιολογήσει την μέθοδο qPCR με TaqMan ανιχνευτές ως προς την ικανότητα ανίχνευσης παθολογικού αριθμού αντιγράφων και να εφαρμόσει το πρωτόκολλο σε ασθενείς HNSCC.
Αρχικά μελετήθηκε το γονίδιο CSMD1 (Chr8, p23.2), το οποίο σύμφωνα με προγενέστερες μελέτες
υφίσταται μειωμένη έκφραση, μεταλλάξεις και μεθυλιώσεις σε διάφορους τύπους καρκίνου,
θεωρείται υποψήφιο ογκοκατασταλτικό γονίδιο, ενώ μελετάται στον HNSCC κυρίως ως προς την
αλλαγή του αριθμού αντιγράφων. Στην παρούσα μελέτη αναλύθηκαν δεδομένα της βάσης TCGA για πλήθος ειδών καρκίνου ως προς τη συχνότητα της παρουσίας γονιδιακών απαλοιφών στο γονίδιο CSMD1. Παρατηρήθηκε ότι ο HNSCC φέρει το υψηλότερο ποσοστό διαγραφών στο γονίδιο αυτό με διαγραφές στο 22,63% των ασθενών. Λαμβάνοντας υπόψη την συχνή παρουσία απαλοιφών στην περιοχή 8p πολλά είδη καρκίνου κρίθηκε χρήσιμο να μελετηθεί μεγαλύτερη έκταση του χρωμοσώματος 8 γύρω από το γονίδιο CSMD1 με σκοπό να αξιολογηθούν πιθανές διαγραφές και σε άλλα γονίδια στην περιοχή 8p23.3 με 8p12. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση 496 δειγμάτων ασθενών με HNSCC από το TCGA ως προς την παρουσία απαλοιφών στην περιοχή αυτή. Παρατηρήθηκε η πολύ αυξημένη παρουσία διαγραφών στο γονίδιο CSMD1 σε σχέση με οποιοδήποτε άλλο γονίδιο καθώς και η σταδιακή μείωση των διαγραφών στα δείγματα μετά την περιοχή του γονιδίου CSMD1 (p23.2) προς την περιοχή p12. Τα δεδομένα αυτά χρησιμοποιήθηκαν για την κατηγοριοποίηση των ασθενών σε υποομάδες που εμφανίζουν κοινά μοτίβα απαλοιφών. Οι ασθενείς που έφεραν απαλοιφή μόνο στο γονίδιο CSMD1 (ομάδα ONLY CSMD1 DELETED), που έφεραν απαλοιφές σε γονίδια της περιοχής p23.3 - p23.1 του χρωμοσώματος 8 (ομάδα p23.3 - p23.1 DELETED) και που δεν έφεραν απαλοιφές (ομάδα NOT DELETED) μελετήθηκαν περεταίρω, αξιοποιώντας τα εργαλεία σύγκρισης μοριακών χαρακτηριστικών που παρέχει η πλατφόρμα cBioPortal, ως προς την παρουσία μεταλλαγών στα
γονίδια BRCA2, RAD52, ATM και BRCA1 που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση με ομόλογο
ανασυνδιασμό καθώς και στα γονίδια HRAS, SOS2, SOS1, BRAF που σχετίζονται με το μοριακό
μονοπάτι RAS. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ομάδα ασθενών ONLY CSMD1 DELETED έχει σαφώς αυξημένα ποσοστά μεταλλαγών στα γονίδια που συμμετέχουν στην επιδιόρθωση με ομόλογο ανασυνδιασμό σε σχέση με τις άλλες ομάδες. Οι μεγαλύτερες διαφορές σημειώθηκαν στα γονίδια BRCA2 και RAD52 με στατιστικώς σημαντική διαφορά από τις άλλες ομάδες. Σχετικά με το μοριακό μονοπάτι RAS παρατηρήθηκε ότι η ομάδα ασθενών p23.3 - p23.1 DELETED έδειξε αυξημένη συχνότητα μεταλλαγών στα γονίδια που μελετήθηκαν σε σχέση με τις άλλες δύο ομάδες με σημαντικότερες τις διαφορές στα γονίδια HRAS και SOS2. Συνολικά μέσω της μετα-ανάλυσης δεδομένων ασθενών της βάσης TCGA προέκυψε το συμπέρασμα ότι πιθανόν διαφορετικοί βιολογικοί μηχανισμοί συνδέονται με διαφορετικά προφίλ απαλοιφών στην συγκεκριμένη χρωμοσωμική περιοχή. Οι ασθενείς που έφεραν στοχευμένη απαλοιφή μόνο στο γονίδιο CSMD1 έδειξαν αυξημένη μεταλλαξιμότητα σε γονίδια του ομόλογου ανασυνδιασμού ενώ οι ασθενείς με εκτεταμένες απαλοιφές στο άκρο του βραχίονα 8p έδειξαν αυξημένες μεταλλαγές σε γονίδια που εμπλέκονται στο μοριακό μονοπάτι HRAS.
Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της ποσοτικής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qPCR) με TaqMan ανιχνευτές για την ανίχνευση αλλαγών στον αριθμό αντιγράφων (CNAs). Επιλέχθηκαν assays για τον εντοπισμό του αριθμού αντιγράφων των γονιδίων DLGAP2, CSMD1, PINX1 της περιοχής p23.3 - p23.1 του χρωμοσώματος 8 και πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της μεθόδου για τον προσδιορισμό των CNAs σε πλήθος καρκινικών κυτταρικών σειρών που διέθεταν δεδομένα για την παρουσία ή απουσία απαλοιφών από κλινικές μελέτες στην πλατφόρμα cBioPortal. Αναλύθηκαν οι καρκινικές κυτταρικές σειρές DLD1, A549, HCT116, BB49, SKMEL28, SKOV3 με απουσία απαλοιφών στο 8p, οι CAL33, RT112, SCC25, PC3 με παρουσία απαλοιφών στα γονίδια DLGAP2, CSMD1, PINX1 και οι TCCSUP, A375, SF268 με παρουσία απαλοιφών μόνο στο γονίδιο CSMD1. Παρατηρήθηκε ότι οι διαφορές των τιμών των κυτταρικών σειρών με απαλοιφές βρέθηκαν στατιστικώς σημαντικά μικρότερες από τις τιμές των κυτταρικών σειρών με φυσιολογικό αριθμό αντιγράφων και για τα τρία γονίδια ενδιαφέροντος. Το γεγονός αυτό αποδεικνύει ότι σε όλες τις περιπτώσεις η μέθοδος πέτυχε τον αποτελεσματικό εντοπισμό των απαλοιφών και τον διαχωρισμό από τα δείγματα με φυσιολογικό αριθμό αντιγράφων.
Ακολούθησε η εφαρμογή της μεθόδου σε δείγματα ασθενών που έφεραν γνωστές μεταλλαγές στα
γονίδια BRCA1, BRCA2, ATM, RAD50, BLM που εμπλέκονται στον ομόλογο ανασυνδιασμό καθώς και διαφορετικές μεταλλάξεις στο γονίδιο HRAS. Συνολικά αναλύθηκαν δώδεκα δείγματα ασθενών με έξι ασθενείς για κάθε μια από τις παραπάνω κατηγορίες. Η χρήση της μεθόδου έδειξε και στις δύο περιπτώσεις ότι ένας στους έξι ασθενείς έφερε στοχευμένη απαλοιφή στο CSMD1 στην περίπτωση των ασθενών με μεταλλαγές στον ομόλογο ανασυνδιασμό ή απαλοιφές στα τρία γονίδια DLGAP2, CSMD1, PINX1 στην περίπτωση ασθενών με μεταλλαγές στο HRAS. Το αποτέλεσμα αυτό συνάδει με τα ευρήματα της μετα-ανάλυσης δεδομένων από το TCGA και πιθανόν αποκαλύπτει μια βιολογική σύνδεση μεταξύ της παρουσίας μεταλλαγών στα γονίδια του ομόλογου ανασυνδιασμού ή του μοριακού μονοπατιού HRAS και της δημιουργίας συγκεκριμένου προφίλ απαλοιφών στο 8p. Για την εγκυρότητα των ευρημάτων επιβάλλεται η μελλοντική εφαρμογή της μεθόδου σε μεγαλύτερο εύρος δειγμάτων. Η κατανόηση των μοριακών μονοπατιών που χαρακτηρίζουν τον HNSCC και η κατηγοριοποίηση των ασθενών με βάση τα μοναδικά μοριακά χαρακτηριστικά τους μπορεί να επιτρέψει την έγκαιρη και ακριβή διάγνωση και την προσαρμογή των θεραπευτικών παρεμβάσεων ώστε να ανταποκρίνονται στα συγκεκριμένα μοριακά προφίλ των ασθενών. Τέτοιες στοχευμένες θεραπείες υπόσχονται αυξημένη αποτελεσματικότητα με λιγότερες παρενέργειες, βελτιστοποιώντας τη θεραπευτική ανταπόκριση.
Λέξεις-κλειδιά:
Καρκίνος Κεφαλής και Τραχήλου, Γονιδιακές Απαλοιφές, Γονίδιο CSMD1, Χρωμόσωμα 8, Αντιγραφικό Στρες
