Περίληψη:
Ο καρκίνος του μαστού (Breast Cancer, BrCa) είναι η πιο συχνή μορφή καρκίνου στις γυναίκες, παγκοσμίως. Παρ’ όλο που αποτελεί μια τόσο συχνή και σοβαρή κακοήθεια, τα επιτεύγματα της σύγχρονης κλινικής και φαρμακευτικής ογκολογίας την καθιστούν ιάσιμη και στην πλειονότητα των περιπτώσεων, εφόσον όμως διαγνωστεί εγκαίρως. Η εμφάνιση της νόσου σχετίζεται συνήθως με τον συνδυασμό γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων, ενώ μπορεί να ταξινομηθεί σε σποραδικό, οικογενή ή κληρονομικό καρκίνο του μαστού. Ο BrCa αναπτύσσεται κυρίως στους λοβούς και στους γαλακτοφόρους πόρους των μαστών και είναι μια συστηματική νόσος που μπορεί να εξαπλωθεί σε όλο το σώμα. Κάθε υπότυπος παρουσιάζει μεγάλη ετερογένεια σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο, με διακριτά παθολογικά χαρακτηριστικά και κλινικά αποτελέσματα, επηρεάζοντας τον σχεδιασμό και την επιλογή της θεραπείας. Η χρήση του προσυμπτωματικού ελέγχου, κυρίως της μαστογραφίας, και η ένταξή του στην ετήσια κλινική ρουτίνα γυναικών άνω των 40 ετών, έχει οδηγήσει στην έγκαιρη διάγνωση και καλύτερη αντιμετώπιση ασθενών. Ακόμα και σήμερα, η «gold standard» μέθοδος διάγνωσης είναι η βιοψία, η οποία δίνει σημαντικές πληροφορίες για τον τύπο του όγκου και την επιλογή της κατάλληλης θεραπείας.
Η εξέλιξη του καρκίνου του μαστού συνδέεται κυρίως με δύο καλά χαρακτηρισμένες οδούς: το προφίλ έκφρασης διαφόρων υποδοχέων (όπως οιστρογονικοί υποδοχείς, υποδοχείς προγεστερόνης και υποδοχείς επιδερμικού αυξητικού παράγοντα) και τον βαθμό και πολλαπλασιασμό του όγκου. Οι τρεις κύριοι υπότυποι καρκίνου μαστού είναι: α) θετικός για υποδοχείς ορμονών οιστρογόνων και προγεστερόνης (ER+ ή PR+), β) με υπερέκφραση του ογκογονιδίου ERBB2 (HER2+), και γ) τριπλά αρνητικός καρκίνος του μαστού (TNBC) (ER-, PR-, HER2-). Παρότι δεν έχει γίνει πλήρως κατανοητός ο μηχανισμός ογκογένεσης, φαίνεται ότι μπορεί να προκληθεί από στεροειδείς ορμόνες του φύλου, μεταλλάξεις σε ογκογονίδια (π.χ. EGFR, ERBB2) και απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (π.χ. BRCA1, BRCA2). Με τον προσδιορισμό καρκινικών βιοδεικτών στα βιολογικά υλικά μπορεί να ληφθούν σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την διάγνωση, την πρόγνωση καθώς και την παρακολούθηση θεραπείας. Μερικά επικυρωμένα μοριακά τεστ για τον καρκίνο του μαστού είναι: Oncotype DX, MammaPrint και uPA/PAI-1. Οι περισσότερες μορφές BrCa αντιμετωπίζονται αρχικά με χειρουργική επέμβαση και ανάλογα με την περίπτωση ακολουθεί χημειοθεραπεία, ορμονοθεραπεία, ακτινοθεραπεία ή συνδυασμός αυτών. Παρά την αποτελεσματικότητα των υφιστάμενων θεραπειών για τον BrCa, επισημαίνεται ότι αυτές συνοδεύονται από ποικίλα μειονεκτήματα που επηρεάζουν την ποιότητα ζωής των ασθενών. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνονται η απώλεια μαλλιών, η κόπωση καθώς και οι ψυχολογικές επιπτώσεις που οφείλονται εν μέρει στην μαστεκτομή και τη δια βίου παρακολούθηση των ασθενών. Ακόμη και σήμερα, οι τρέχοντες κλινικοί δείκτες αδυνατούν στην έγκαιρη διάγνωση και εξατομικευμένη πρόγνωση της νόσου. Επομένως, υπάρχει ανάγκη για την ταυτοποίηση νέων μοριακών βιοδεικτών σύμφωνα με τις επιταγές της ιατρικής ακρίβειας.
Τα μη κωδικά μόρια RNA αποτελούν μετάγραφα RNA που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες και χωρίζονται σε δύο κατηγορίες ως προς το μέγεθός τους: μεγάλα μη κωδικά RNA (lncRNAs, >200 nt) και τα μικρά μη κωδικά RNA (sncRNAs, <200 nt). Πληθώρα μελετών έχουν αναδείξει τον καθοριστικό ρόλο των sncRNAs στη ρύθμιση των σηματοδοτικών μονοπατιών που ευνοούν την εξέλιξη του BrCa. Τα microRNAs (miRNAs), ανήκουν στην ομάδα των sncRNA, και ρυθμίζουν αρνητικά την γονιδιακή έκφραση, μέσω της δέσμευσής τους στις 3’-αμετάφραστες περιοχές (3’-UTR) των μεταγράφων τους. Τα ογκογονίδια ERBB2 και EGFR υπερεκφράζονται στον BrCa και φαίνεται ότι μπορεί να γίνουν στόχος από διάφορα miRNAs. Η μελέτη των miRNAs, που στοχεύουν ογκογονίδια στον BrCa, έχει κεντρίσει τα τελευταία χρόνια το παγκόσμιο ερευνητικό ενδιαφέρον, θέτοντας ως στόχο την ανακάλυψη νέων μοριακών βιοδεικτών και θεραπευτικών στόχων για την ακριβή πρόβλεψη της πορείας της νόσου και την αποτελεσματικότερη εξατομικευμένη θεραπεία.
Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η μελέτη έκφρασης και η κλινική αξιολόγηση ενός πάνελ miRNAs (miR-26b, miR-143 και miR-205), τα οποία στοχεύουν τα ογκογονίδια ERBB2 και EGFR στον καρκίνο του μαστού. Για τους σκοπούς της εργασίας, χρησιμοποιήθηκαν 82 δείγματα ιστού, εκ των οποίων 41 δείγματα από όγκους μαστού και 41 δείγματα φυσιολογικού παρακείμενου ιστού. Αρχικά, έγινε απομόνωση του ολικού RNA από τα ιστοτεμάχια και ακολούθησε 3’-πολυαδενυλίωση και αντίστροφη μεταγραφή του ολικού RNA. Στη συνέχεια, έγινε in silico ανάλυση χρησιμοποιώντας τις βάσεις δεδομένων miRDB, miRwalk και Diana-Micro αναζητώντας τα miRNAs που στοχεύουν τα ογκογονίδια ERBB2 και EGFR στον BrCa. Από τις βάσεις αυτές, επιλέχθηκαν τα miRNAs που εμφανίζονταν κοινά και στις τρεις βάσεις. Ακολούθησε εκτενής βιβλιογραφική αναζήτηση για την επιλογή των επικυρωμένων miRNAs που στοχεύουν τα συγκεκριμένα ογκογονίδια. Στη συνέχεια, αξιοποιήθηκαν οι ομάδες ασθενών TCGA-BrCa και Metabric και το δημόσια διαθέσιμο εργαλείο KMplotter (https://kmplot.com/analysis/) και πραγματοποιήθηκε κλινική αξιολόγηση και ανάλυση επιβίωσης. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης ανέδειξαν την επιλογή των τελικών τριών miRNAs (miR-26b, miR-143 και miR-205) για την μελέτη τους στην ομάδα ελέγχου. Κατόπιν, έγινε ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μεθοδολογίας για την ποσοτικοποίηση των miR-26b, miR-143 και miR-205, μέσω ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (Real Time qPCR), χρησιμοποιώντας το φθορισμογόνο ανιχνευτή SYBR Green I. Τέλος, για την κλινική αξιολόγηση των miRNAs ενδιαφέροντος ως βιοδείκτες διάγνωσης και πρόγνωσης στον καρκίνο του μαστού, έγινε μια εκτενής βιοστατιστική ανάλυση με τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών.
Από τα αποτελέσματα της στατιστικής ανάλυσης, φαίνεται ότι τα miRNAs ενδιαφέροντος μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες διαφοροδιάγνωσης, για την ανίχνευση καρκίνου μαστού. Και στις τρεις περιπτώσεις, τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs παρουσίασαν μια στατιστικά σημαντική μείωση στο καρκινικό σε σύγκριση με το φυσιολογικό μέρος ιστού του μαστού. Η ανάλυση καμπύλων ευαισθησίας-ειδικότητας, κατέδειξε το miRNA-26b ως βέλτιστο δείκτη, καθώς παρουσιάζει το μεγαλύτερο εμβαδόν κάτω από την καμπύλη (AUC=0.858), υποδηλώνοντας ανώτερη διαγνωστική αξία. Επίσης, λήφθηκαν αρκετά ενδιαφέροντα αποτελέσματα από τη μελέτη της πιθανής σχέσης ανάμεσα στην έκφραση των miRNAs ενδιαφέροντος και διαφόρων κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών. Και τα τρία miRNAs είχαν στατιστικά σημαντικά μειωμένα επίπεδα έκφρασης σε PR+ όγκους σε σχέση με τους όγκους που δεν εκφράζουν υποδοχέα προγεστερόνης. Το miRNA-26b φάνηκε να εμφανίζει μια στατιστικά σημαντική μείωση στα επίπεδα έκφρασης του σε όγκους που είχαν εξαπλωθεί σε γειτονικούς λεμφαδένες (Ν+) σε σύγκριση με τους όγκους που δεν είχαν εξαπλωθεί σε λεμφαδένες (Ν0). Όσον αφορά το miR-143, τα επίπεδα έκφρασης του συγκεκριμένου μορίου φάνηκε να σχετίζονται με τον ιστολογικό βαθμό κακοήθειας, όπου παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική αύξηση τους σε όγκους υψηλού βαθμού κακοήθειας (Grade III) σε σχέση με όγκους χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας (Grades I και ΙΙ). Το miRNA-205 ήταν το μόριο με τις περισσότερες συσχετίσεις επιπέδων έκφρασης και κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών. Η έκφραση του miRNA-205 φάνηκε να είναι αυξημένη σε όγκους TNBC σε σύγκριση με τους όγκους των υπολοίπων μοριακών υποτύπων (Luminal A, Luminal B, HER2). Επίσης, παρατηρήθηκε μια στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων του miR-205 σε όγκους υψηλού βαθμού κακοήθειας (Grade III), σε σχέση με τους όγκους Grade I και ΙΙ. Επιπρόσθετα, μειωμένα επίπεδα έκφρασης του miR-205 παρατηρήθηκαν στου ER+ σε σχέση με τους όγκους που δεν εκφράζουν υποδοχείς οιστρογόνων. Τέλος, αυξημένα επίπεδα του miR-205, ανιχνεύτηκαν σε όγκους μαστού που είναι θετικοί ως προς την έκφραση του πυρηνικού αντιγόνου Ki-67, σε σύγκριση με τους όγκους που είχαν χαμηλή έκφραση του Ki-67.
Συμπερασματικά, τα miR-26b, miR-143 και miR-205 φαίνεται να είναι πολύ υποσχόμενα μόρια για την διάγνωση καρκίνου μαστού. Επίσης, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την διάκριση των κλινικοπαθολογικών χαρακτηριστικών των ασθενών και έτσι να συμβάλλουν στη σωστή επιλογή εξατομικευμένης θεραπείας. Παρ’ όλα αυτά είναι αναγκαία η περαιτέρω μελέτη τους όσον αφορά στην συμβολή τους στην πρόβλεψη της της εξέλιξης της νόσου και της επιβίωσης των ασθενών.
