Περίληψη:
Το πολλαπλό μυέλωμα (ΜΜ), αν και θεωρείται μια σπάνια ασθένεια, είναι η δεύτερη πιο κοινή αιματολογική κακοήθεια και εντοπίζεται στο φάσμα των πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών. Σε αρκετές περιπτώσεις ξεκινάει από την μονοκλωνική γαμμαπάθεια αδιευκρίνιστης σημασίας (MGUS), και διέρχεται μέσω ενός ενδιάμεσου σταδίου που χαρακτηρίζεται ως έρπων πολλαπλό μυέλωμα (sMM). Η εξέλιξη της νόσου από τα καλοήθη πρόδρομα στάδια στο θανατηφόρο κακοήθες ΜΜ εξαρτάται από ένα σύμπλεγμα παραγόντων που δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητοί. Το χαρακτηριστικό ορόσημο αυτής της πάθησης είναι ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός των πλασματοκυττάρων στο μυελό των οστών, με αποτέλεσμα την παραγωγή και έκκριση μη λειτουργικών ανοσοσφαιρινών. Οι βελτιώσεις στη θεραπεία του ΜΜ τις τελευταίες δεκαετίες, ξεκινώντας από τη χρήση της μεταμόσχευσης αυτόλογων βλαστοκυττάρων που ακολουθήθηκε από τη διαθεσιμότητα των νέων θεραπειών όπως τα ανοσοτροποποιητικά φάρμακα (IMIDs) και οι αναστολείς πρωτεασώματος (PIs), έχουν μεταμορφώσει την ιστορία της νόσου οδηγώντας σε μεγαλύτερους χρόνους επιβίωσης. Παρόλα αυτά τα υψηλά ποσοστά υποτροπών και η εξαιρετικά ετερογενής ανταπόκριση στη θεραπεία παρεμποδίζει την αξιόπιστη πρόγνωση και την εξατομικευμένη θεραπευτική, υπογραμμίζοντας την επείγουσα ανάγκη για την οριοθέτηση καινοτόμων προγνωστικών δεικτών που πρέπει να ενσωματωθούν στην κλινική περίθαλψη. Συνεπώς η εύρεση νέων μοριακών βιοδεικτών είναι επιτακτική ανάγκη για την βελτιστοποίηση της πρόγνωσης , της διάγνωσης και της επίβλεψης των ασθενών. Σε αυτό το πλαίσιο, οι τεχνικές υψηλής απόδοσης έχουν αποκαλύψει τα microRNAs, ως ισχυρούς μετα-μεταγραφικούς ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης με κρίσιμες επιπτώσεις στην εμφάνιση και στην εξέλιξη του καρκίνου. Η εμφάνιση αυτών των τεχνικών αποκάλυψε ότι τα miRNAs απορρυθμίζονται σε όλους τους ανθρώπινους όγκους και ανέδειξαν τη χρησιμότητα τους ως πιθανούς προγνωστικούς δείκτες. Με βάση αυτά τα δεδομένα αποφασίσαμε για τους σκοπούς της παρούσας διπλωματικής εργασίας να ερευνήσουμε τα επίπεδα έκφρασης και την κλινική σημασία των microRNAs στο πολλαπλό μυέλωμα. Τα εν λόγο μόρια είναι μικρά μη κωδικά RNA μόρια, μήκους 19-25 νουκλεοτιδίων που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση προκαλώντας την αναστολή της μετάφρασης ή την πλήρη αποικοδόμηση των mRNA στόχων τους μέσω της συμπληρωματικότητας των βάσεων τους. Προσδένονται στη 3’-αμετάφραστη περιοχή (3’-UTR) των mRNA-στόχων μέσω μια αλληλουχίας 6-8 νουκλεοτιδίων (seed region) που έχουν κοντά στο 5’ άκρο τους.
Στο πλαίσιο αυτό, πραγματοποιήθηκε μια εκτενής βιβλιογραφική αναζήτηση για μόρια microRNA που έχει δειχθεί ότι εμπλέκονται ενεργά στους καρκίνους και στοχεύουν ισχυρά γονίδια του κυτταρικού κύκλου. Επιλέχθηκαν τα miR-34a-5p, miR-106b-5p, miR-221-3p και miR-222-3p για τα οποία θελήσαμε να αναπτύξουμε ένα πρωτόκολλο in-house qPCR, με το οποίο θα ενισχύαμε ειδικά αυτά τα μόρια και θα μπορούσαν να ανιχνευθούν ποσοτικά. Παρόλου που έγινε βελτιστοποίηση και για τα 4 μόρια, επιλέχθηκαν μόνο τα miR-221-3p και miR-222-3p για περαιτέρω μελέτη στους ασθενείς. Χρησιμοποιήθηκε ένας στατιστικά ικανό πλήθος δειγμάτων (n=167), εκ των οποίων ήταν ΜΜ (n=130), με sMM (n=28) και με MGUS (n=9). Μονοπύρηνα κύτταρα απομονώθηκαν από μυελό των οστών μέσω Ficoll-Paque, ενώ CD138+ πλασματοκύτταρα επιλέχθηκαν με μαγνητικό διαχωρισμό σωματιδίων συνδεδεμένων με ειδικά anti-CD138 mAbs. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού RNA, πολυαδενυλίωση στο 3’-άκρο του και αντίστροφη μεταγραφή με χρήση oligo(dT)-adapter εκκινητή. Τα επίπεδα του miR-221-3p και miR-222-3p, ποσοτικοποιήθηκαν με in-house qPCR μεθοδολογία. Η ολική επιβίωση (OS), η επιβίωση-ελευθέρας εξέλιξης (PFS) και η επιβίωση σχετιζόμενη με τον καρκίνο, αξιοποιήθηκαν για την ανάλυση επιβίωσης και τη μετα-θεραπευτική παρακολούθηση των ασθενών. Τα αποτελέσματα που λάβαμε από την στατιστική ανάλυση παρουσίασαν ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Αρχικά τα επίπεδα του miR-221-3p ήταν χαμηλότερα σε ασθενείς με ΜΜ σε σχέση με αυτούς με sMM/MGUS (p=0,030), γεγονός που υποδεικνύει ότι το μόριο αυτό μπορεί να λειτουργήσει δυνητικά ως πιθανός διαφοροδιαγνωστικός δείκτης. Επιπλέον τα χαμηλά επίπεδα του συγκεκριμένου μορίου συσχετίστηκαν στατιστικά σημαντικά με τα αυξημένα επίπεδα του διαγνωστικού δείκτη b2m (p=0,059) αλλά και με τη ικανότητα σταδιοποίησης των ασθενών καθώς ήταν σημαντικά μειωμένα στους ασθενείς που βρίσκονται στην RISS III σε σχέση με αυτούς που βρίσκονται στα RISS I/II (p=0,052). Επίσης το miR-221-3p θα μπορούσε να είναι ένας δείκτης για τη πρόγνωση της νόσου. Πιο συγκεκριμένα, τα μειωμένα επίπεδα του συσχετίστηκαν αρνητικά με την ολική επιβίωση (p=0,040) και με την επιβίωση των ασθενών χωρίς εξέλιξη της νόσου για το χρονικό διάστημα της μελέτης (p=0,003). Η ισχυρή αυτή προγνωστική αξία των επιπέδων του miR-221-3p επιβεβαιώθηκαν και από την ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox. Ομοίως για το miR-222-3p, τα επίπεδα του ήταν σημαντικά μειωμένα στους ασθενείς με υψηλές τιμές b2m (p=0,091) και στους ασθενείς ΜΜ που βρίσκονται στα στάδια RISS III έναντι των RISS I/II (p=0,036). Επιπλέον η ανάλυση επιβίωσης μέσω καμπυλών Kaplan-Meier υπογράμμισε τη στατιστικά σημαντική συσχέτιση των χαμηλών επιπέδων του μορίου με την ολική επιβίωση των ασθενών (p=0,015), την εξέλιξη της νόσου μετά από κάποιο θεραπευτικό πρωτόκολλο (p=0,004) και τους θανάτους από το συγκεκριμένο τύπο καρκίνου (p=0,022). Η ισχυρή προγνωστική αξία των επιπέδων του miR-222-3p για τους παραπάνω προγνωστικούς δείκτες επιβεβαιώθηκα με ανάλυση παλινδρόμησης κατά Cox. Συνολικά, το miR-221-3p θα μπορούσε να θεωρηθεί ως πιθανός διαφοροδιαγνωστικός δείκτης ανάμεσα σε ασθενείς με ΜΜ και sMM/MGUS, ενώ συγχρόνως τα χαμηλά επίπεδα τόσο του miR-221-3p και του miR-222-3p θα μπορούσαν να αποτελέσουν δυο δείκτες κακής προγνωστικής αξίας και ολικής επιβίωσης των ασθενών.
Λέξεις-κλειδιά:
πολλαπλό μυέλωμα , καρκίνος , μη κωδικά μόρια RNA, miR-221, miR-222
