Τμήμα Ιατρικής
Βιβλιοθήκη Επιστημών Υγείας

2024-06-14

2024

Λεάνδρου Εμμανουέλα

Γεώργιος Παρασκευάς, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ, Επιβλέπων
Κώστας Βεκρέλλης, Ερευνητής Α’, Κέντρο Βασικής Έρευνας, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών
Ευαγγελία Εμμανουηλίδου, Επίκουρη Καθηγήτρια, Τμήμα Χημείας, ΕΚΠΑ
Λεωνίδας Στεφανής, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Παναγιώτα Παπαζαφείρη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Αγγελική Χρόνη, Ερευνήτρια Α΄, Ινστιτούτο Βιοεπιστημών και Εφαρμογών, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»
Δήμητρα Θωμαΐδου, Ερευνήτρια Α΄, Τμήμα Νευροβιολογίας, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ

Διερεύνηση μηχανισμών μετάδοσης της παθολογίας της α-συνουκλεΐνης σε μοντέλα παρκινσονισμού

Αγγλικά

Διερεύνηση μηχανισμών μετάδοσης της παθολογίας της α-συνουκλεΐνης σε μοντέλα παρκινσονισμού

Η α-συνουκλεΐνη είναι μια μικρή προ-συναπτική νευρωνική πρωτεΐνη, βιοχημικά και γενετικά συνδεδεμένη με τη εμφάνιση παθολογίας στη Νόσο Πάρκινσον (ΝΠ). Για αρκετά χρόνια θεωρούνταν ότι η α-συνουκλεΐνη βρίσκεται αποκλειστικά στο κυτταρόπλασμα των νευρικών κυττάρων μέχρι που πρόσφατες μελέτες έδειξαν την ύπαρξή της στον εξωκυττάριο χώρο. Ωστόσο, παρόλο που η α-συνουκλεΐνη έχει εντοπιστεί εξωκυττάρια, δεν διαθέτει πεπτίδιο αναγνώρισης για έκκριση προκειμένου να ακολουθεί το κλασσικό μονοπάτι έκκρισης πρωτεϊνών και μέχρι σήμερα δεν έχει αποσαφηνιστεί ο μηχανισμός έκκρισης της, υπό φυσιολογικές ή/και παθολογικές συνθήκες. Τα επίπεδα εξωκυττάριας α-συνουκλεΐνης έχουν σημαντικό ρόλο αφού έχουν ενοχοποιηθεί για την μετάδοση της παθολογίας από κύτταρο σε κύτταρο στις διαφορετικές περιοχές του εγκεφάλου που χαρακτηρίζει την εξέλιξη της ΝΠ.
Το πρώτο μέρος της παρούσας μελέτης επικεντρώνεται στη διερεύνηση του μοριακού μονοπατιού για την έκκριση της α-συνουκλεΐνης στον εγκέφαλο μυών, το οποίο ενεργοποιείται από την αύξηση των ενδοκυττάριων επιπέδων ασβεστίου μέσω των τασεο-ελεγχόμενων διαύλων ασβεστίου (Voltage-gated Calcium Channels, VGCCs), με έμφαση στην ταυτοποίηση και στόχευση των συγκεκριμένων VGCCs τόσο in vitro όσο και in vivo. Αρχικά, ο μηχανισμός έκκρισης της α-συνουκλεΐνης μελετήθηκε με τη διεξαγωγή in vitro πειραμάτων σε εμβρυϊκούς φλοιικούς νευρώνες μυών, όπου τα επίπεδα της εκκρινόμενης α-συνουκλεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με μια ειδική για την α-συνουκλεΐνη ELISA, μετά την εφαρμογή εκλεκτικών αναστολέων για κάθε τύπο VGCC. Η λειτουργικότητα των αναστολέων επιβεβαιώθηκε με φθορισμομετρική μέτρηση της συγκέντρωσης του ασβεστίου σε πραγματικό χρόνο σε λειτουργικούς εμβρυϊκούς φλοιικούς νευρώνες μυών. In vivo, η έκκριση της α-συνουκλεΐνης μελετήθηκε σε διαγονιδιακούς μύες που εκφράζουν την ανθρώπινη A53T μεταλλαγμένη μορφή της α-συνουκλεΐνης. Η συμμετοχή των VGCCs στην έκκριση της α-συνουκλεΐνης εκτιμήθηκε ύστερα από τοπική χορήγηση ειδικών αναστολέων μέσω in vivo αντίστροφης μικροδιύλυσης στο ραβδωτό σώμα των Α53Τ μυών. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τα παραπάνω πειράματα έδειξαν ότι η έκκριση της α-συνουκλεΐνης in vitro και in vivo είναι μια διαδικασία που εξαρτάται από τα VGCCs και η οποία στο ραβδωτό σώμα των μυών φαίνεται να ρυθμίζεται, τουλάχιστον σε μεγάλο βαθμό, από τα VGCCs τύπου Ν, ενώ τα VGCCs τύπου L και P/Q δεν φαίνεται να επηρεάζουν την έκκριση της α-συνουκλεΐνης.
Η έκκριση της α-συνουκλεΐνης είναι μία φυσιολογική λειτουργική απόκριση των νευρικών κυττάρων. Όμως, η μη φυσιολογική έκκριση της α-συνουκλεΐνης πιθανόν να οδηγεί στη δημιουργία συσσωματωμένων δομών που επάγουν τη νευροφλεγμονή επιδεινώνοντας περαιτέρω τον νευροεκφυλισμό που παρατηρείται στους ασθενείς με ΝΠ. Παρόλο που είναι γνωστό ότι η α-συνουκλεΐνη μπορεί να φαγοκυτταρωθεί από τη μικρογλοία και/ή τα αστροκύτταρα και να οδηγήσει σε έναρξη της νευροφλεγμονής, τα μοριακά μονοπάτια που πυροδοτούν και παρατείνουν τη φλεγμονή στον εγκέφαλο των ασθενών με ΝΠ, παραμένουν ασαφή.
Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, προκειμένου να ελεγχθεί ο ρόλος της συσσωμάτωσης της α-συνουκλεΐνης στην επαγωγή νευροφλεγμονής, χρησιμοποιήθηκε το διαγονιδιακό μοντέλο της Α53Τ α-συνουκλεΐνης στο οποίο τα νευρικά κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα συσσωματωμένης/ολιγομερούς α-συνουκλεΐνης και παρουσιάζουν αυξημένους δείκτες νευροφλεγμονής. Μέσω συνδυασμού μοριακών και βιοχημικών τεχνικών, η παρουσία ολιγομερών α-συνουκλεΐνης συσχετίστηκε με παρατεταμένες φλεγμονώδεις αποκρίσεις, όπως έδειξαν οι σημαντικές αυξήσεις στα επίπεδα των ενδογενών IgG αντισωμάτων στους Α53Τ μύες, καθώς και των προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών (TNFα, IFNγ και IL1β). Με χρήση ανοσοφθορισμού και ειδικής για το TNFα ELISA σε πρωτογενείς καλλιέργειες μικρογλοίας, επιβεβαιώθηκε ότι η ολιγομερής, και όχι η μονομερής, μορφή της α-συνουκλεΐνης είναι εκείνη που ενεργοποιεί τη μικρογλοία.
Σε επόμενα πειράματα μέσω τρισδιάστατης κυτταρικής ανακατασκευής, η μορφομετρική ανάλυση των αστροκυττάρων που ήταν θετικά έναντι στον αστροκυτταρικό δείκτη GFAP αποκάλυψε αυξημένο αριθμό αστροκυττάρων και διακριτές μορφολογικές αλλοιώσεις στα αστροκύτταρα του ραβδωτού σώματος των A53T μυών, σε σύγκριση με τους μύες άγριου τύπου. Περαιτέρω ανάλυση με χρήση ανοσοφθορισμού και ανοσοαποτύπωσης κατά Western αποκάλυψε την ενεργοποίηση του p38MAPK σηματοδοτικού μονοπατιού στη μικρογλοία καθώς και τη διέγερση του NF-κB σηματοδοτικού μονοπατιού στα αστροκύτταρα. Μελέτες μέτρησης ανοσοφθορισμού σε μεμονωμένα GFAP+ αστροκύτταρα έδειξαν επίσης αυξημένη έκφραση των Cav3.2 καναλιών ασβεστίου στο ραβδωτό σώμα των A53T μυών, σε σύγκριση με τους μύες άγριου τύπου.
Για τη περαιτέρω διερεύνηση του μοριακού μηχανισμού επαγωγής των αστροκυτταρικών Cav3.2 καναλιών ασβεστίου στους Α53Τ μύες, χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενή αστροκύτταρα μυών που βρίσκονταν σε κατάσταση ηρεμίας. Χορήγηση κυτταροκινών στα πρωτογενή αστροκύτταρα οδήγησε σε ενεργοποίηση του NF-κB μονοπατιού και αύξηση των επιπέδων λειτουργικών Cav3.2 καναλιών ασβεστίου αποδεικνύοντας τη συσχέτιση των Cav3.2 καναλιών ασβεστίου με την επαγωγή του NF-κB. Για να βρεθεί ποιες αστροκυτταρικές πρωτεΐνες εκκρίνονται μέσω του Cav3.2 διαύλου, έγινε πρωτεομική ανάλυση με LC-MS/MS του εκκριτικού περιβάλλοντος αστροκύτταρων, ύστερα από υπερεκφράση του Cav3.2 καναλιού ασβεστίου. Μέσω αυτής της πειραματικής προσέγγισης, αναδείχτηκε η έκκριση της πρωτεΐνης, IGFBPL1, η οποία αποτελεί ισχυρό ρυθμιστή της αξονικής ανάπτυξης των νευρώνων.
Εν κατακλείδι, η ταυτοποίηση του ρυθμιστικού ρόλου που παίζει ένας συγκεκριμένος τύπος καναλιού ασβεστίου στην έκκριση της α-συνουκλεΐνης, θέτει τις βάσεις για την επιλεκτική φαρμακολογική στόχευση αυτού του καναλιού, με σκοπό να ρυθμιστούν τα επίπεδα της εκκρινόμενης α-συνουκλεΐνης. Όταν η α-συνουκλεΐνη υπερ-εκκρίνεται στο διάμεσο υγρό του εγκεφάλου, τότε ευνοείται η συσσώρευσή της, η οποία οδηγεί σε δημιουργία νευροφλεγμονής. Τα δεδομένα της πρωτεομικής μαζί με την απουσία νευρωνικού θανάτου στους A53T μύες υποδηλώνουν ότι η αύξηση των επιπέδων του αστροκυτταρικού Cav3.2 καναλιού λειτουργεί ως αντισταθμιστικός μηχανισμός που προστατεύει τους νευρώνες από τη φλεγμονή που προέρχεται από την συσσώρευση των ολιγομερών μορφών της α-συνουκλεΐνης.

Επιστήμες Υγείας

Νόσος Πάρκινσον, Α-συνουκλεΐνη, Σηματοδότηση ασβεστίου, Νευροφλεγμονή

Όχι

0

Ναι

505

208

Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο έως 2027-06-18.

https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/3401158