Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Δρ. Διαμάντης Σίδερης, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ,
Δρ. Δημήτρης Θάνος, Ακαδημαϊκός, Ερευνητής Α’, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών (ΙΙΒΕΑΑ)
Δρ. Δημήτριος Στραβοπόδης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ,
Δρ. Διδώ Βασιλακοπούλου, Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ,
Δρ. Παναγιώτα Παπαζαφείρη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ,
Δρ. Δήμητρα Θωμαΐδου, Ερευνήτρια Α’, Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ,
Δρ. Παναγιώτης Πολίτης, Ερευνητής Β’, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών της Ακαδημίας Αθηνών (ΙΙΒΕΑΑ)
Περίληψη:
Ο κυτταρικός επαναπρογραμματισμός σωματικών κυττάρων προς επαγόμενα πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα (iPSCs) πραγματοποιείται μέσω της υπέρ-έκφρασης τεσσάρων μεταγραφικών παραγόντων, των Oct4, Sox2, Klf4 και c-Myc (OSKM). Λόγω της υψηλής πολυπλοκότητας του φαινομένου, του μεγάλου αριθμού των εμπλεκόμενων μορίων και της στοχαστικής και αναποτελεσματικής του φύσης, δεν έχουν αποκαλυφθεί ακόμα όλοι οι μοριακοί μηχανισμοί που το διέπουν. Σκοπός της παρούσας Διατριβής ήταν η ταυτοποίηση ρυθμιστικών στοιχείων του γονιδιώματος τα οποία ενεργοποιούνται κατά τη διάρκεια του επαναπρογραμματισμού, η διερεύνηση του τρόπου με τον οποίο δρουν και ο συσχετισμός τους με την έκφραση σημαντικών γονιδίων. Για την επίτευξη των ανωτέρω στόχων χρησιμοποιήθηκε συνδυασμός διαφορετικών μοριακών, απεικονιστικών τεχνικών, γονιδιωματικών προσεγγίσεων υψηλής απόδοσης και μεθόδων υπολογιστικής βιολογίας.
Αρχικά διαμορφώσαμε ένα συνδυαστικό ChIP-seq σετ δεδομένων για τους OSKM προερχόμενο από πειράματα πολλαπλών δημοσιευμένων μελετών σε κύτταρα MEFs (Mouse Embryonic Fibroblasts), με σκοπό να μελετήσουμε την πρόσδεση των OSKM στο γονιδίωμα ανεξάρτητα από μικροδιαφορές μεταξύ των διαφορετικών συστημάτων και πρωτοκόλλων επαναπρογραμματισμού. Αρχικά εστιάσαμε στις ESC-σχετιζόμενες περιοχές (Embryonic Stem Cells, φυσικό ανάλογο των iPSCs) και διαπιστώσαμε ότι σχεδόν το 1/3 αυτών προσδένονται από τους OSKM ήδη από την 1η ημέρα του επαναπρογραμματισμού, ή/και από το στάδιο των MEFs («Early-bound ESC θέσεις»). Η ανάλυσή μας ανέδειξε το σημαντικό ρόλο του Myc στον επαναπρογραμματισμό, ο οποίος συχνά παραβλέπεται. Διαπιστώσαμε ότι μαζί με τον Klf4 «μαρκάρουν» θέσεις οι οποίες κατά τον επαναπρογραμματισμό θα καταληφθούν από τους Oct4 και Sox2. Περαιτέρω, ανακαλύψαμε ότι αρκετά γονίδια ρυθμίζονται παράλληλα από πολλαπλές γενωμικές θέσεις, όπου οι OSKM μπορεί να προσδένονται με διαφορετικό χρονικό πρότυπο. Για παράδειγμα, πολλά γονίδια τα οποία σχετίζονται με την -απαραίτητη για τον επαναπρογραμματισμό- διαδικασία της MET (Mesenchymal to Epithelial Transition) βρίσκονται ταυτόχρονα κοντά σε ESC-, MEF- και Transient-OSKM θέσεις, με αποτέλεσμα η έκφρασή τους να είναι σταθερά υψηλή, αλλά να επάγεται περαιτέρω στα ενδιάμεσα χρονικά σημεία του φαινομένου. Τέλος, παρατηρήσαμε ότι οι OSKM πολύ συχνά προσδένονται στη χρωματίνη με δυναμικό τρόπο. Αυτή η «on-and-off» σχέση των OSKM με το γονιδίωμα σχετίζεται με την ανάγκη αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης ώστε να εγκαθιδρυθεί η πολυδυναμία.
Σκεφτήκαμε να εκμεταλλευτούμε τα δεδομένα της γονιδιωματικής ανάλυσης που πραγματοποιήσαμε, ώστε να ταυτοποιήσουμε ρυθμιστικά στοιχεία επαγόμενα κατά τον επαναπρογραμματισμό (Reprogramming Inducible Enhancers, RIEs) και να χρησιμοποιήσουμε την ενεργοποίησή τους ως πρώιμο δείκτη της επιτυχημένης απόκτησης πολυδυναμίας. Δηλαδή, θελήσαμε να χρησιμοποιήσουμε τους RIEs ως «παγίδες» (enhancer traps) για την ανίχνευση κυττάρων τα οποία επαναπρογραμματίζονται με αυξημένη αποτελεσματικότητα. Για το σκοπό αυτό εστιάσαμε στις ESC θέσεις πρόσδεσης οι οποίες καταλαμβάνονται από τους OSKM νωρίς, αλλά μόνο έπειτα από το στάδιο των MEFs (ημέρα 1, «de novo Early-bound ESC θέσεις»). Από τα επαγώγιμα αυτά στοιχεία επιλέξαμε τις περιοχές με υψηλό αριθμό γεγονότων πρόσδεσης από τους OSKM (peaks), οι οποίες βρίσκονται κοντά σε γονίδια (0-2,5kb ανοδικά, ή καθοδικά) που υπέρ-εκφράζονται στον επαναπρογραμματισμό, ώστε να καταλήξουμε σε γενωμικές περιοχές με χαρακτηριστικά ενισχυτών. Από αυτές αποφασίσαμε ενδεικτικά να εστιάσουμε σε 3 περιοχές ανοδικά από τα γονίδια Lefty1, Pou5f1 (Oct4) και Upp1, τις οποίες κλωνοποιήσαμε άνωθεν του γονιδίου GFP για την πραγματοποίηση δοκιμασιών αναφοράς. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι και τα τρία στοιχεία DNA (Lefty1-700, Pou5f1-1800, Upp1-800) δρουν ως ενισχυτές και επάγονται σε κύτταρα MEFs τα οποία αποκτούν επιθηλιακό φαινότυπο (MET) και συχνά διαμορφώνουν πρώιμες αποικίες iPSC. Μάλιστα, ο ενισχυτής Upp1-800, σε αντίθεση με τους άλλους δύο, διαθέτει όλες τις απαραίτητες αλληλουχίες για τη ρύθμιση της έκφρασης του αντίστοιχου γονιδίου καθ’ όλη τη διάρκεια του επαναπρογραμματισμού. Κύτταρα τα οποία επιλέχθηκαν την ημέρα 4 με βάση την ενεργοποίηση του Upp1-800 (Upp1-800-GFP(+) κύτταρα) επαναπρογραμματίζονται με κατά μέσο όρο διπλάσια αποτελεσματικότητα σε σχέση με τον υπόλοιπο πληθυσμό (Upp1-800-GFP(-) κύτταρα). Συνεπώς, μέσω της αμερόληπτης μεθόδου αναγνώρισης πιθανών RIE ενισχυτών την οποία αναπτύξαμε, ταυτοποιήσαμε ένα νέο πρώιμο δείκτη επαναπρογραμματισμού, τον ενισχυτή Upp1-800.
Στη συνέχεια, θελήσαμε να χρησιμοποιήσουμε αυτό το νέο δείκτη ώστε να μελετήσουμε τα κύτταρα τα οποία «μαρκάρει» και να αποκαλύψουμε νέους, μη μελετημένους μηχανισμούς του κυτταρικού επαναπρογραμματισμού. Στο πλαίσιο αυτό πραγματοποιήσαμε ανάλυση μεταγραφωμάτος (RNA-seq) στα Upp1-800-GFP(+) και GFP(-) κύτταρα κατά τα πρώιμα στάδια του επαναπρογραμματισμού (ημέρα 2-4). Διαπιστώσαμε ότι ο ενισχυτής Upp1-800 επισημαίνει τα κύτταρα όπου ενεργοποιούνται γονιδιακά δίκτυα σχετιζόμενα με τo μονοπάτι της MET και τα οποία παρουσιάζουν αυξημένη έκφραση των 9TR παραγόντων Gli2 και Irf6 και της μεταλλοπεπτιδάσης Mmp9. Από παλαιότερα πειράματα του εργαστηρίου μας γνωρίζουμε ότι το δίκτυο των 9TRs χρειάζεται για την ενεργοποίηση του Nanog και την απόκτηση πολυδυναμίας και η δράση της Mmp9 είναι σημαντική για την επιτυχημένη ολοκλήρωση του επαναπρογραμματισμού. Βασιζόμενοι στα αποτελέσματα της ανάλυσης RNA-seq και σε άλλες αναλύσεις καταλήξαμε σε ένα πιθανό μοντέλο που περιγράφει την εξέλιξη των μοριακών γεγονότων τα οποία συμβάλλουν στην αποτελεσματική παραγωγή αποικιών iPSC από τα Upp1-800-GFP(+) κύτταρα. Αναλυτικά, η αποτελεσματική υπέρ-έκφραση των διαγονιδίων των OSKM τις 2 πρώτες ημέρες του επαναπρογραμματισμού οδηγεί στην παροδική επαγωγή των παραγόντων Gli2 και Irf6, μέσω της άμεσης πρόσδεσής τους στις αντίστοιχες ρυθμιστικές περιοχές (ημέρα 2-4). Παράλληλα, οι OSKM ενεργοποιούν τον enhancer-reporter Upp1-800, οδηγώντας στην έκφραση της GFP (Upp1-800-GFP(+) κύτταρα). Ο Irf6, με τη σειρά του, προσδένεται στη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της Mmp9 και του Nanog, και τα επάγει. Αυτό συμβάλλει στη φαινοτυπική μεταβολή των κυττάρων και στην εγκαθίδρυση της πολυδυναμίας. Αντίθετα, στα GFP(-) κύτταρα οι OSKM εκφράζονται σε σχετικά χαμηλότερα επίπεδα τις 2 πρώτες ημέρες, με αποτέλεσμα να καθυστερεί η υπέρ-έκφραση των Irf6 και Gli2, και να μην επιτυγχάνεται η έκφραση του γονιδίου της Mmp9 και του Nanog σε υψηλά επίπεδα.
Τέλος, ενδιαφερθήκαμε να διερευνήσουμε τον τρόπο με τον οποίο η μεταλλοπεπτιδάση Mmp9 συμβάλλει στην απόκτηση της πολυδυναμίας. Μελέτη του μεταγραφώματος κυττάρων στα οποία πραγματοποιήθηκε μεταγραφική σίγαση ή χημική αναστολή της MMP9 επιβεβαίωσε παλαιότερα πειράματα του εργαστηρίου, υπογραμμίζοντας το ρόλο της στην επιθηλιοποίηση (ΜΕΤ). Πιο αναλυτικά, απουσία της δράσης της Mmp9 διαπιστώσαμε ότι υπέρ-εκφράζονται κλασικοί μεσεγχυματικοί δείκτες, ενώ μειώνεται η έκφραση επιθηλιακών γονιδίων και δεικτών του επαναπρογραμματισμού. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η Mmp9 διαμορφώνει ένα κύκλο θετικής ανατροφοδότησης με τους παράγοντες Irf6 και Nanog, καθώς αφενός αυτοί προσδένονται στη ρυθμιστική της περιοχή επάγοντας την έκφρασή της και αφετέρου η Mmp9 συντηρεί ή/και διασφαλίζει την έκφραση των δυο αυτών γονιδίων. Εκτός από τη MET, η Mmp9 επηρεάζει πολλαπλές άλλες κυτταρικές λειτουργίες, όπως τον κυτταρικό θάνατο, το μεταβολισμό και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της άμεσης ή έμμεσης επίδρασης της μεταλλοπεπτιδάσης στην έκφραση πολλαπλών κομβικών γονιδίων όπως είναι τα Cdh1 (E-cad), Acta2 και Mapk3.
Συνοψίζοντας, στο πλαίσιο της παρούσας Διατριβής μελετήσαμε τη δραστηριότητα των OSKM στον κυτταρικό επαναπρογραμματισμό και αναπτύξαμε μια αμερόληπτη μεθοδολογία για την αναγνώριση και λειτουργική μελέτη στοιχείων στο DNA με ρόλο RIE ενισχυτών. Μέσω αυτής ταυτοποιήσαμε έναν νέο πρώιμο δείκτη επαναπρογραμματισμού και ανακαλύψαμε σημαντικούς μοριακούς μηχανισμούς οι οποίοι τελούνται στα κύτταρα τα οποία επαναπρογραμματίζονται. Προτείναμε ένα μοντέλο το οποίο συνδέει τη δράση των OSKM, των παραγόντων 9TR και της μεταλλοπεπτιδάσης 9 και αναδείξαμε για πρώτη φορά με λεπτομέρεια τον κομβικό και πλειοτροπικό ρόλο της Mmp9 στον επαναπρογραμματισμό.
