Μονάδα:
Τμήμα ΒιολογίαςΒιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών
Ημερομηνία κατάθεσης:
2024-12-19
Συγγραφέας:
Γιαννάκου Μαρία
Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Dimitris G. Hatzinikolaou, Professor of Microbial Biotechnology, Biology Dpt, University of Athens
Georgios Skretas, Director, Institute for Bio-innovation, Biomedical Sciences Research Center "Alex. Fleming"
Constantinos E. Vorgias, Professor of Biochemistry, Biology Dpt, University of Athens
Emmanuel Mikros, Professor of Pharmaceutical Chemistry, Pharmacy Dept, University of Athens
Vasileios Myrianthopoulos, Assistant Professor of Pharmaceutical Chemistry, Pharmacy Dept, University of Athens
Ieronymos-Jerome Zoidakis, Assistant Professor of Biochemistry-Molecular Biology, Biology Dpt, University of Athens
Evagelos Gikas, Professor of Analytical Chemistry, Chemistry Dept, University of Athens
Πρωτότυπος Τίτλος:
«Εφαρμογή μεθόδων Συνθετικής Βιολογίας & Μοριακής εξέλιξης για την ανακάλυψη δυνητικών θεραπευτικών μορίων κατά νευροεκφυλιστικών ασθενειών που προκαλούνται από προβληματική πρωτεϊνική αναδίπλωση & συσσωμάτωση»
Γλώσσες διατριβής:
Αγγλικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
«Εφαρμογή μεθόδων Συνθετικής Βιολογίας & Μοριακής εξέλιξης για την ανακάλυψη δυνητικών θεραπευτικών μορίων κατά νευροεκφυλιστικών ασθενειών που προκαλούνται από προβληματική πρωτεϊνική αναδίπλωση & συσσωμάτωση»
Περίληψη:
Η Cu/Zn δισμουτάση του υπεροξειδίου (SOD1) είναι ένα ομοδιμερές ένζυμο που εκφράζεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα και καταλύει την αντίδραση μετατροπής των ριζών υπεροξειδίου O2- σε O2 και H2O2. Πρόκειται για ένα μεταλλοένζυμο που περιέχει χαλκό χάρη στον οποίο επιτυγχάνεται η οξειδοαναγωγική του δράση, ψευδάργυρο που σταθεροποιεί τη διαμόρφωση του διμερούς και έναν ενδομοριακό δισουλφιδικό δεσμό.
Μεταλλάξεις στη SOD1 έχουν συσχετιστεί με την αμυοτροφική πλευρική σκλήρυνση (Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), μια πολύ σοβαρή και ανίατη νευροεκφυλιστική ασθένεια των κινητικών νευρώνων, η οποία εξελίσσεται ταχέως και οδηγεί στο θάνατο 3-5 χρόνια μετά την αρχική διάγνωση. Κάποιες μεταλλάξεις σχετίζονται με μείωση της δραστηριότητας του ενζύμου, αλλά η τοξική τους δράση στα νευρικά κύτταρα προκαλείται μέσω ενός μηχανισμού πρόσδοσης νέας λειτουργίας (gain of function): διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν μεταλλαγμένη SOD1 αναπτύσσουν συμπτώματα της νόσου, ενώ σε ποντίκια που έχει γίνει διαγραφή του γονιδίου που την κωδικοποιεί, αυτά δεν είναι επιρρεπή σε απώλεια κινητικών νευρώνων.
Ο μηχανισμός με τον οποίο οι μεταλλάξεις της SOD1 προκαλούν επιλεκτικό θάνατο των νευρικών κυττάρων δεν έχει αποσαφηνιστεί ακόμα, ωστόσο η παρουσία τους σχετίζεται με: μειωμένη ενεργότητα ενζύμου, αλλαγές στη λειτουργία των μεταφορέων γλουταμικού που σχετίζονται με γλουταμική τοξικότητα εκ διεγέρσεως, διατάραξη της ομοιόστασης του χαλκού και αυξημένη τάση της πρωτεΐνης για λανθασμένη αναδίπλωση και συνακόλουθη συσσωμάτωση, μηχανισμός στον οποίο εστιάζει η παρούσα διατριβή.
Ουβικιτυλιωμένα πρωτεΐνικά συσσωματώματα που περιέχουν SOD1 στο κυτταρόπλασμα των κινητικών νευρώνων αποτελούν αδιαμφισβήτητο εύρημα και χαρακτηριστικό γνώρισμα της νόσου. Η παρούσα εργασία περιγράφει την πορεία ανακάλυψης ενώσεων ως αναστολείς συσσωμάτωσης της SOD1 που φέρει τη μεταλλαγή A4V, με πιθανή θεραπευτική δράση έναντι της ALS, χρησιμοποιώντας δύο προσεγγίσεις.
Στην πρώτη προσέγγιση πραγματοποιήθηκε in vitro σάρωση μιας χαρακτηρισμένης βιβλιοθήκης 1280 φαρμακολογικά ενεργών ενώσεων, της LOPAC®. Κάθε ένωση αξιολογήθηκε ως προς την ικανότητά της να αυξάνει τη θερμική σταθερότητα της SOD1(A4V) με την τεχνική φθορισμομετρίας διαφορικής σάρωσης (DSF). Η DSF είναι μια βιοφυσική τεχνική που ποσοτικοποιεί τη θερμική σταθερότητα μιας πρωτεΐνης εξάγοντας τη θερμοκρασία τήξης (Tm) της είτε μόνης της είτε στο πλαίσιο αλληλεπίδρασης φαρμάκου-πρωτεΐνης. H υπόθεση εργασίας είναι ότι ενώσεις που αυξάνουν την Tm, σημαίνει ότι προσδένονται στη φυσικη της διαμόρφωση και τη σταθεροποιούν, οπότε είναι πιθανό να καθυστερούν ή να αναστέλλουν τη συσσωμάτωσή της. Τελικά, εντοπίστηκε μια ένωση ικανή να μετατοπίσει την Tm της πρωτεΐνης κατά 7oC, έντεκα ενώσεις οδήγησαν στην εμφάνιση δεύτερης Tm μεγαλύτερης από αυτό της πρωτεΐνης, ενώ πέντε ενώσεις βρέθηκαν να μειώνουν την Tm μέχρι 18oC, υποδηλώνοντας πιθανή αλληλεπίδραση ή/και μη ειδική πρόσδεση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα των υπολογισμών μοριακής πρόσδεσης υποστηρίζουν την υπόθεσή μας ότι οι 12 ενώσεις, που προκάλεσαν αύξηση του Tm της συγκεκριμένης μεταλλαγής, προσδένονται κοντά στο αμινοξύ Cys111 (Pocket 1) μια περιοχή, κρίσιμης σημασίας στην κινητική συσσωμάτωσης, και λόγω της συμμετοχής της σε ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις με άλλες ενώσεις ικανές να σταθεροποιούν την πρωτεΐνη.
Στη δεύτερη προσέγγιση, πραγματοποιήθηκε αρχική αξιολόγηση επιλεγμένων κυκλικών μορίων που είχαν προηγουμένως προκύψει από την εφαρμογή βακτηριακής πλατφόρμας όπου συνδυαστικές βιβλιοθήκες κυκλικών επταπεπτιδίων βιοσυντίθενται μέσα σε κύτταρα Escherichia coli και ταυτόχρονα αξιολογούνται για την ικανότητά τους να αναστέλλουν τη συσσωμάτωση της SOD1(A4V). Στο σύστημα αυτό, είχαν παραχθεί περίπου 192 εκατομμύρια διαφορετικά κυκλικά επταπεπτίδια αποτελούμενα από τα είκοσι φυσικά αμινοξέα, τα οποία και αξιολογήθηκαν μέσω συστήματος σάρωσης υψηλής απόδοσης για τον εντοπισμό μορίων που αποτρέπουν τη συσσωμάτωση της παθογόνου παραλλαγής SOD1(A4V).
Επιλεγμένα μόρια που προέκυψαν από τις προαναφερθείσες προσεγγίσεις επανεξετάστηκαν σε δευτερεύοντα in vitro πειράματα χρησιμοποιώντας απομονωμένη SOD1(A4V) που παράγεται από κύτταρα E. coli. Συγκεκριμένα, με πειράματα κινητικής συσσωμάτωσης της SOD1(A4V) παρουσία και απουσία των ενώσεων αυτών παραρακολουθήθηκε εάν η προσθήκη κάθε ένωσης είναι ικανή να αναστέλλει ή να τροποποιεί τη συσσωμάτωση. Η ικανότητα μείωσης της αμυλοειδογόνου συσσωμάτωσης αξιολογήθηκε με χρώση θειοφλαβίνης Τ (ThT), η οποία είναι μια χρωστική ικανή να φθορίζει κατά τη δέσμευση της σε δομές β-φύλλου, χαρακτηριστικό του σχηματισμού αμυλοειδούς (ή τύπου αμυλοειδούς). Επιπλέον, με τη χρήση της τεχνικής Δυναμικής Σκέδασης Φωτός (DLS) παρακολουθήθηκε η κατανομή των διαφορετικών ειδών συσσωματωμάτων της SOD1, δίνοντάς μας μια ιδέα για το μέγεθος των δομών που σχηματίζονται.
Τα επταπεπτίδια P1 και P2 προκάλεσαν στατιστικά σημαντική μείωση της χρώσης ThT υποδηλώνοντας πιθανή αναστολή της συσσωμάτωσης SOD1(A4V) ή σχηματισμό δομών που είναι πιο άμορφες ή που στις οποίες έχει μειωθεί η συνιστώσα αμυλοειδογονικότητας. Στη συνέχεια , πειράματα με χρήση DLS επέδειξαν ότι το μέγεθος των δομών που σχηματίζονται κατά την κινητική συσσωμάτωσης της SOD1(A4V) είναι όμοιο με αυτό απουσία πεπτιδίων, υποδηλώνοντας ότι πιθανώς αυτά τα δύο πεπτίδια δρουν ως ρυθμιστές της συσσωμάτωσης SOD1 παρά ως αναστολείς της.
Ο αναλυτικός μηχανισμός της δράσης τους μπορεί να αποκρυπτογραφηθεί περαιτέρω και να επικυρωθεί με in vivo πειράματα χρησιμοποιώντας κύτταρα ή μοντέλα μικρών ζώων, καθώς γενικά οι in vitro τεχνικές δεν μπορούν να προβλέψουν το αποτέλεσμα της διαφοροποίησης των οδών παθογένεσης που προκαλείται από την παρουσία των πεπτιδίων.
Κύρια θεματική κατηγορία:
Θετικές Επιστήμες
Λοιπές θεματικές κατηγορίες:
Επιστήμες Υγείας
Λέξεις-κλειδιά:
ALS, SOD1, προβληματική αναδίπλωση πρωτεϊνών, ανακάλυψη φαρμάκων, επαναχρησιμοποίηση φαρμάκων σάρωση χημικής βιβλιοθήκης, Τεχνική DSF (διαφορική φθορισμομετρία σάρωσης), πλασμιδιακή, βιβλιοθήκη, συνθετική βιολογία, σάρωσης μικροβιακής βιβλιοθήκης, κυκλικά πεπτίδια
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
0
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
516
Αρχείο:
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο έως 2027-12-20.
ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ_ΓΙΑΝΝΑΚΟΥ_EKΠΑ.pdf
8 MB
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο έως 2027-12-20.
