Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Αικατερίνη Μαρία Παππά, Επίκουρη Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας , Ε.Κ.Π.Α.
Uldis Kalnenieks, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Λετονίας
Άννα-Ειρήνη Κούκκου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων
Κωνσταντίνος Ε. Βοργιάς, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας , Ε.Κ.Π.Α.
Δημήτριος Χατζηνικολάου, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.
Βασίλειος Κουβέλης, Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας , Ε.Κ.Π.Α.
Βασιλική Α. Οικονομίδου, Επίκουρη Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.
Περίληψη:
Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής υπήρξε η μελέτη της SOS απόκρισης στο Zymomonas mobilis. Η SOS απόκριση (SOS response) εκδηλώνεται στα βακτήρια σε καταστάσεις εκτεταμένης μεταλλαξογένεσης και πρόκλησης βλαβών στο DNA, και έγκειται στη συντονισμένη επαγωγή γονιδίων που εμπλέκονται κυρίως στην αντιγραφή και επιδιόρθωση του DNA ή στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Ρυθμιστές των γονιδίων που επάγονται κατά την SOS απόκριση – των λεγόμενων SOS γονιδίων – είναι οι πρωτεΐνες RecA και LexA, από τις οποίες η πρώτη είναι η κύρια πρωτεΐνη του ομόλογου γενετικού ανασυνδυασμού και η δεύτερη ο μεταγραφικός καταστολέας όλων των SOS γονιδίων. Παρουσία βλαβών στο DNA, και δη μονόκλωνων αλυσίδων που προκύπτουν από θραύσεις, η RecA ενεργοποιείται και υποβοηθά τη LexA στην αυτοπρωτεόλυσή της. Αυτό έχει ως επακόλουθο την αποδέσμευση της τελευταίας από τις θέσεις πρόσδεσής της ανοδικά των SOS γονιδίων και την αποκαταστολή αυτών, συμπεριλαμβανομένων των recA και lexA. Η εκ νέου σύνθεση της LexA, όπως και η σταδιακή επιδιόρθωση των βλαβών, κατασιγάζει την επαγωγή και επαναφέρει τον οργανισμό στην ιδιοστατική κατάσταση. Το SOS σύστημα έχει κατά κύριο λόγο μελετηθεί στο γ-πρωτεοβακτήριο Escherichia coli, αλλά στοιχεία του εύρους και των λειτουργιών του ανακαλύπτονται προσφάτως και σε άλλους οργανισμούς, όπως τα α-πρωτεοβακτήρια.
Το Zymomonas mobilis είναι ζυμωτικό α-πρωτεοβακτήριο με έντονο βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον εξαιτίας της ικανότητάς του για παραγωγή αιθανόλης με σχεδόν τέλειους ρυθμούς και αποδόσεις, καθώς και προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η δυνατότητα ζύμωσης υδρολυμάτων αμυλώδους ή αδρής βιομάζας καθιστούν προσφάτως τον οργανισμό αυτό εξαιρετικά σημαντικό στην παραγωγή βιοκαυσίμων (βιοαιθανόλης) πρώτης και δεύτερης γενιάς. Για τον λόγο αυτό, στο εργαστήριο μελετάται ο συγκεκριμένος οργανισμός σε επίπεδο γενετικό, γονιδιωματικό και κατασκευής στελεχών.
Η μελέτη της SOS απόκρισης στο Z. mobilis ενδιέφερε στα πλαίσια της παρούσας διατριβής καθώς θα διαφώτιζε τη συμπεριφορά του οργανισμού σε συνθήκες μεταλλακτικού στρες και θα αναδείκνυε επίσης το πρώτο επαγώγιμο σύστημα γονιδίων που ουδέποτε έχει χαρακτηριστεί σ’ αυτόν. Εργαλεία για τη μελέτη αποτέλεσαν (α) ένα στέλεχος recA- που δημιουργήθηκε με απαλοιφή του γονιδίου recA του βιομηχανικού στελέχους Z. mobilis CP4 και (β) βιοπληροφορική ανάλυση των γονιδίων recA και lexA και των προβλεπόμενων προϊόντων τους, καθώς και ανάλυση των πρώτων αλληλουχημένων γονιδιωμάτων του Z. mobilis για ενδείξεις στοιχείων SOS-ρύθμισης, που πραγματοποιήθηκαν σε προηγούμενες έρευνες του υποψηφίου διδάκτορα.
Στην παρούσα διατριβή, επεκτάθηκαν οι μελέτες στο κατασκευασμένο CP4 recA- στέλεχος, το οποίο ονομάστηκε UA1. Επιβεβαιώθηκε με μοριακή ανάλυση η καθαρότητα και μοναδικότητα της εισδοχής του γονιδίου της ακετυλοτρανσφεράσης της χλωραμφαινικόλης (catΕ), που είχε χρησιμοποιηθεί για τη γονιδιακή απαλοιφή του ενδογενούς recA, και διαπιστώθηκε η διατήρηση της ανθεκτικότητας του UA1 στη χλωραμφαινικόλη σε συνεχείς ανακαλλιέργειες άνευ πίεσης επιλογής, γεγονός που πιστοποιεί τον σταθερά μεταλλαγμένο του χαρακτήρα. Το UA1 μελετήθηκε επίσης ως προς τις παραμέτρους αύξησής του σε πλήρες και ελάχιστο θρεπτικό υλικό, σε αερόβιες και αναερόβιες συνθήκες, και παρουσία μεταλλαξογόνων, όπως υπεριώδους ακτινοβολίας (UV) και μεθυλ-μεθανοσουλφονικού οξέως (MMS). Απεδείχθη εν γένει πιο αργό στην ανάπτυξη από το πατρικό, περισσότερο θνησιγενές σε φάση στασιμότητας και υπερευαίσθητο κατά πολλές τάξεις μεγέθους στα μεταλλαξογόνα. Τέλος, και σε πλήρη συμφωνία με τον recA- γονότυπό του, το UA1 απεδείχθη ανίκανο να προβαίνει σε ομόλογο γενετικό ανασυνδυασμό.
Για να εξεταστεί εάν η υστέρηση στην ανάπτυξη του UA1 αντανακλά και σε ελαττωμένη παραγωγή αιθανόλης, ελέγχθηκαν η παραγωγή αιθανόλης αυτού και του πατρικού στελέχους σε διαφορετικές φάσεις ανάπτυξης με υγρή και αέριο χρωματογραφία. Και με τις δύο τεχνικές φάνηκε ότι το UA1 παράγει περίπου 3,5 φορές περισσότερη αιθανόλη από το CP4 και η διαφορά αυτή είναι αξιοσημείωτα μεγαλύτερη (5,6 φορές) στη μέση εκθετική φάση αύξησης και όταν η παραγωγή ανάγεται προς τον αριθμό κυττάρων.
Για να διαφανεί, τέλος, η χρησιμότητα του στελέχους UA1 ως εργαλείου σε κατευθύνσεις γενετικής μηχανικής, ελέγχθηκε η δυνατότητά του να προσλαμβάνει DNA μέσω μετασχηματισμού και μέσω σύζευξης. Φάνηκε ότι μετασχηματίζεται με συχνότητες 4-10 φορές χαμηλότερες από το CP4 και συζεύγνηται με συχνότητες ίσες έως 10 φορές χαμηλότερες ανάλογα το παρακινούμενο πλασμίδιο, άρα είναι αρκούντως δεκτικό σε διαδικασίες που απαιτούν εισαγωγές γονιδίων.
Tα recA- στελέχη των περισσοτέρων μικροοργανισμών είναι εξαιρετικά χρήσιμα στη γενετική μηχανική καθώς σταθεροποιούν και δεν ανακατατάσσουν το ξένο γενετικό υλικό που εισάγεται σε αυτά. Για τον λόγο αυτό, καθώς και για τις υπόλοιπες ιδιότητες που προαναφέρθηκαν, το UA1, ως το πρώτο και μόνο recA αρνητικό στέλεχος του Z. mobilis που έχει δημιουργηθεί, έγινε δεκτό προς κατάθεση στην παγκόσμια τράπεζα μικροβιακών στελεχών ATCC (American Type Culture Collection) με προσωρινό κωδικό AcqID-01168.
Για να εξακριβωθεί η ύπαρξη δικτύου SOS γονιδίων στο πατρικό του UA1 στέλεχος CP4, έγινε υπολογιστική αναζήτηση γονιδίων που φέρουν συντηρημένους SOS χειριστές (SOS boxes), σύμφωνους με το α-πρωτεοβακτηριακό SOS μοτίβο ανοδικά των γονιδίων. Η αναζήτηση κατέδειξε τέλειους χειριστές ανοδικά 10 χρωμοσωμικών γονιδίων και 1 πλασμιδιακού, και χειριστές με μία νουκλεοτιδική αλλαγή ανοδικά 58 και 9 γονιδίων, αντίστοιχα. Ανάμεσα σε αυτά εντοπίστηκαν εκτός από επιδιορθωτικά γονίδια, γονίδια μεταβολικά, δομικά, αναπνευστικά, ρυθμιστικά, κ.ά. Ανάλογες συντηρημένες αλληλουχίες χειριστών βρέθηκαν ανοδικά των ίδιων αλληλομόρφων όλων των στελεχών Ζ. mobilis subsp. mobilis που ελέγχθηκαν και των οποίων τα γονιδιώματα είναι πλέον γνωστά (ATCC 31821, ATCC 10988, ATCC 29191 και NCIMB 11163), ενώ διαφορές παρουσιάστηκαν στον μοναδικό αλληλουχημένο αντιπρόσωπο του έτερου υποείδους του Z. mobilis, του Z. mobilis supsp. pomaceae (ΑTCC 29192), ο οποίος φέρει κάποια κοινά και αρκετά καινούργια SOS γονίδια. Επίσης εντοπίστηκαν SOS γονίδια με 0-1 νουκλεοτιδική αλλαγή στον χειριστή τους στα πλασμίδια όλων των στελεχών, με τα περισσότερα τέτοια γονίδια να είναι στελεχοειδικά.
Η SOS επαγωγή μελετήθηκε διεξοδικά στα στελέχη UA1 και CP4 με αλληλούχηση του μεταγραφώματός τους κατόπιν πρόκλησης με το μεταλλαξογόνο MMS, σε κλίμακα συγκεντρώσεων που να επιφέρει μεν επαγωγή αλλά να αποτρέπει άνω της μίας δεκαδικής τάξης πτώση βιωσιμότητας για έκαστο στέλεχος (από 0 ως 0,2 mM για το UA1 και ως 15 mM για το CP4). Για τους σκοπούς της μεταγραφωματικής ανάλυσης, αναπτύχθηκε τεχνική βέλτιστης απομόνωσης RNA από το Z. mobilis, ενώ τα δείγματα εστάλησαν προς δημιουργία βιβλιοθηκών και αλληλούχηση στο US DOE – Joint Genome Institute. Η ανάλυση των μεταγράφων απέδειξε ότι υπό φυσιολογικές συνθήκες και στα δύο στελέχη μεταγράφεται το 97% των προβλεπόμενων χρωμοσωμικών γονιδίων του γονιδιώματος και το 89% των πλασμιδιακών. Σε επίπεδο διαφορικής έκφρασης στις κοινές εφαρμοζόμενες συγκεντρώσεις του MMS, συνολικά 9 διαφορετικά γονίδια του UA1 και 67 του CP4 (διαφορετικά από τα πρώτα), συμπεριλαμβανομένων τριών κλασικών επιδιορθωτικών γονιδίων, φάνηκαν να επάγονται ή καταστέλλονται. Στο UA1 κανένα επιδιορθωτικό γονίδιο δεν επάχθηκε επιβεβαιώνοντας τον μόνιμα κατασταλμένο φαινότυπό του. Το σύνολο των γονιδίων του CP4 που είχαν διαφορική έκφραση σε συνθήκες SOS επαγωγής – το λεγόμενο SOS stimulon – φάνηκε να αριθμεί από 60 γονίδια στην χαμηλότερη συγκέντρωση του μεταλλαξογόνου έως 1.215 στην υψηλότερη (το 73% των μεταγραφόμενων γονιδίων). Χαρακτηριστικά υπερεκφραζόμενα γονίδια, συχνά συμμεταγραφόμενα, υπήρξαν επιδιορθωτικά, συγκρότησης φάγων, απόκρισης σε στρες και σε αντιμικροβιακούς παράγοντες, ρυθμιστικά κ.ά., ενώ χαρακτηριστικά υποεκφραζόμενα ήταν γονίδια του μεταφραστικού μηχανισμού.
Για να βρεθεί το αυστηρώς νοούμενο SOS σύστημα στο Z. mobilis (: το SOS regulon εντός του SOS stimulon), δηλαδή αυτό που ρυθμίζεται από τη LexA και τα γονιδιακά μέλη του οποίου φέρουν μοτίβα SOS χειριστών, αναζητήθηκε υπολογιστικά το σύνολο των επιδιορθωτικών γονιδίων του CP4, καθώς τα τελευταία αποτελούν γνώμονα SOS γονιδίων σε όσους οργανισμούς έχουν μελετηθεί. Φάνηκε ότι ο οργανισμός φέρει 34 γονίδια ορθόλογα με καλά χαρακτηρισμένα των γ-πρωτεοβακτηρίων, εκ των οποίων τα 17 επάγονταν από το MMS ανεξαρτήτως συγκέντρωσης. Ανοδικά και των 17 εντοπίστηκαν μοτίβα SOS χειριστών με 0-3 νουκλεοτιδικές αλλαγές συγκριτικά με το τέλειο συναινετικό μοτίβο. Με βάση αυτό το κριτήριο χαλαρότητας του μοτίβου, αναζητήθηκαν τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια του CP4 στο σύνολο όλων που αντέδρασαν στο ΜΜS και φέρουν ανάλογους SOS χειριστές. Εντοπίστηκαν 340 υπερεκφραζόμενα και 310 υποεκφραζόμενα γονίδια. Τα περισσότερα από αυτά, εκτός των επιδιορθωτικών που προαναφέρθηκαν, συμμετέχουν στη μεταφορά ουσιών, αναδίπλωση πρωτεϊνών, μεταβολισμό υδατανθράκων και αμινοξέων, παραγωγή ενέργειας και τη μεταφραστική μηχανή. SOS-ρυθμιζόμενα γονίδια εντοπίστηκαν και στα πλασμίδια, και ευθύνονται για λειτουργίες όπως μετάθεση και τροποποίηση/περιορισμό του DNA ή συγκρότηση φάγων. Τα περισσότερα γονίδια αυτού του συνόλου πρώτη φορά αναφέρονται ως SOS γονίδια.
Ο εντοπισμός των SOS γονιδίων στο Z. mobilis βοήθησε στην εξεύρεση του ιδιαίτερου μοτίβου που χαρακτηρίζει έναν SOS χειριστή στον οργανισμό, μοτίβου, δηλαδή, που να μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως γνώμονας στη βιοπληροφορική αναζήτηση SOS-ρυθμιζόμενων γονιδίων σε διαφορετικά στελέχη του οργανισμού ή και να διαφωτίσει την SOS ρύθμιση στα α-πρωτεοβακτήρια εν γένει. Για τον σκοπό αυτό στοιχήθηκαν όλοι οι διαμορφωμένοι με τα άνω κριτήρια πιθανοί SOS χειριστές και φάνηκε ότι εσωτερικά δινουκλεοτίδια των επαναλαμβανόμενων τετραμερών των ολικών μοτίβων είναι συντηρημένα άνω του 95% σε σχέση με τα εξωτερικά νουκλεοτίδια των τετραμερών (συντήρηση 30-40%). Επιπλέον, παρατηρήθηκε τάση προτίμησης για βάσεις A/T τόσο στο εσωτερικό των μοτίβων όσο και εκατέρωθεν αυτών. Τέλος, βρέθηκε ότι το 87% των SOS μοτίβων εντοπίζεται έως 200 bp από τη μεταφραστική έναρξη του εκάστοτε γονιδίου.
Σε επίπεδο σύγκλισης των in silico προβλέψεων με τα πειραματικά αποτελέσματα της μεταγραφωματικής ανάλυσης στην παρούσα εργασία, φάνηκε ότι οι βιοπληροφορικές προβλέψεις γονιδίων με SOS χειριστές με 0 ή 1 νουκλεοτιδική αλλαγή επιβεβαιώθηκαν κατά 91,7% και 53,5%, αντίστοιχα. Όμως, οι προβλέψεις κάλυψαν μόνο το 9,4% του συνόλου των γονιδίων που έφεραν SOS χειριστές με τα άνω κριτήρια και είχαν διαφορική έκφραση, καταδεικνύοντας έτσι ότι η πρόβλεψη για χειριστές με 0-1 αλλαγή, που είναι η ευρέως χρησιμοποιούμενη σε συναφείς δημοσιεύσεις, δεν επαρκεί για την εξεύρεση όλου του ρυθμιστικού συστήματος (regulon).
Τέλος, στην εργασία αυτή, σημειώθηκε πρωταρχική μελέτη των υποκινητών των γονιδίων recA και lexA του CP4 ως μοντέλων μοριακής αλληλεπίδρασης της LexA πρωτεΐνης με τον SOS χειριστή. Για τον σκοπό αυτό κλωνοποιήθηκαν οι ευρύτερες περιοχές ανοδικά των γονιδίων recA και lexA σε πλασμίδιο ελέγχου μεταγραφικής ενεργότητας σταθερό σε α- και γ-πρωτεοβακτήρια, και εισήχθησαν τα κατασκευασμένα πλασμίδια σε κύτταρα (α) E. coli, που εξέφραζαν ή όχι in trans τη LexA του CP4 από φορέα υπερέκφρασης, και (β) A. tumefaciens, που εξέφραζαν in trans την οικεία χρωμοσωμική και ομόλογη με του Z. mobilis, LexA, εφόσον προσπάθειες να εισαχθούν στο ίδιο το Z. mobilis δεν τελεσφόρησαν. Οι υποκινητές αποδείχθηκαν ενεργοί και στους δύο ξενιστές με δυνατότερο αυτόν του recA. Η παρουσία της LexA του Z. mobilis στο E. coli οδήγησε σε καταστολή έως και ~60%, ενθαρρύνοντας το εγχείρημα της μελέτης μοριακών αλληλεπιδράσεων χειριστή – καταστολέα στον οργανισμό αυτό. Eπίσης, στο A. tumefaciens και κατόπιν SOS επαγωγής, υπήρξε οριακή αποκαταστολή των υποκινητών, αναδεικνύοντας και πάλι ότι με βελτίωση του ετερόλογου αυτού συστήματος δύναται να πραγματοποιηθεί η επιθυμητή μελέτη.
