Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Δαΐκος Γεώργιος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Τζουβελέκης Λεωνίδας, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Αντωνιάδου Αναστασία, Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Παπαπαρασκευάς Ιωσήφ, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Σαμάρκος Μιχαήλ, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Ψυχογυιού Μήνα, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Πουλάκου Γαρυφαλλιά, Επίκουρη Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Σκοπός: Με τη μελέτη αυτή, έγινε προσπάθεια καταγραφής των κυρίων χαρακτη-ριστικών των νοσοκομειακών στελεχών Klebsiella pneumoniae που απομονώθηκαν από ασθενείς με μικροβιαιμία, καθώς επίσης και προσπάθεια προσδιορισμού παραγόντων που ευθύνονται για τη λοιμογόνο δράση τους, με έμφαση στον πανδημικό κλώνο ST258. Συγκεκριμένα, εξετάσαμε: α) την ύπαρξη γονιδίων που προσδίδουν στα στελέχη ST258 αυξημένη λοιμογονικότητα, β) την ευαισθησία των στελεχών ST258 στον ορό και το συμπλήρωμα, γ) την φαγοκυττάρωσή τους από μακροφάγα, δ) τη λοιμογονικότητά τους in vivo σε ζωικό μοντέλο σήψης και ε) την ικανότητά τους να εγείρουν το εγγενές ανοσοποιητικό σύστημα, όπως αυτό εκφράζεται με την παραγωγή των προφλεγμονωδών κυτταροκινών IL-1β, IL-6, TNF-α, καθώς και με την μεταγραφική ικανότητα της IL-1β και του πρωτεϊνικού συμπλέγματος NLRP3 του φλεγμονοσώματος, τα οποία έχουν καθοριστικό ρόλο στην ενεργοποίηση της πρωτογενούς ανοσιακής απάντησης του οργανισμού.
Μεθοδολογία: Ελέγχθηκαν συνολικά 190 στελέχη K. pneumoniae που απομονώ-θηκαν από ασθενείς με μικροβιαιμία σε 2 μεγάλα τριτοβάθμια νοσοκομεία της Αθήνας, κατά την περίοδο 1/8/2009 έως 30/11/2010. Έγινε έλεγχος για την παραγωγή καρβαπενεμασών με δίσκους εμποτισμένους με EDTA, βορονικό οξύ και συνδυασμό αυτών καθώς και προσδιορισμός γονιδίων blakpc και blavim, με PCR. Ακολούθησε μοριακή τυποποίηση με PFGE 123 στελεχών που είχαν τυποποιηθεί ως KPC. Στη συνέχεια, έως και 2 στελέχη από κάθε PFGE-κλάσμα (cluster) ελέγχθηκαν για 7 γονίδια (gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB και tonB), με MLST. Από τον κλώνο ST258 επελέγησαν 3 στελέχη από τα PFGE-κλάσματα με υπερίσχυση του κλώνου ST-258, και προσδιορίστηκε ο ορότυπος κάψας. Σε στέλεχος αντιπροσωπευτικό του κλώνου ST258 (L-78, κλάδος Ι), καθώς και στο υπερλοιμογόνο στέλεχος ATCC 43816 (ορότυπος Κ2) το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας, ελέγχθηκε η ευαισθησία στη βακτηριοκτόνο δράση ορού υγιών εθελοντών και η φαγοκυττάρωσή τους από την κυτταρική σειρά J774A.1 μακροφάγων ποντικού BALB/c. Έγινε επίσης in vivo εξέταση της λοιμογονικότητας των στελεχών L-78 και ATCC 43816 σε μοντέλο σήψης, μετά από πρόκληση λοίμωξης ανοσοεπαρκών και ουδετεροπενικών θηλυκών ποντικών ICR. Σε 20 στελέχη έγινε έλεγχος με PCR μιας σειράς γονιδίων που προσδίδουν αυξημένη λοιμογονικότητα (magA, alls, rmpA, mrkD, kfu, cf29a, fimH, uge, wabG, urea, ybtS, entB/entE και iroN). Τέλος, έγινε μελέτη της ανοσολογικής απάντησης σε κυτταροκαλλιέργειες μακροφάγων ποντικού, μετά από διέγερσή τους με τα στελέχη K. pneumoniae: L-78 (ST258, κλάδος Ι) και ATCC 43816 (μάρτυρας), καθώς και με LPS, και προσδιορίστηκαν οι προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες IL-1β, ΙL-6 και ΤNF-α με τη μέθοδο ELISA. H μεταγραφική ικανότητα της IL-1β και του πρωτεϊνικού συμπλέγματος NLRP3 του φλεγμονοσώματος εξετάστηκαν με τη μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής σε μια ποσοτική-πραγματικού χρόνου qPCR, με προσδιορισμό της έκφρασης του mRNA.
Αποτελέσματα: Στα 190 στελέχη βρέθηκαν 38 VIM, 29 KPC-VIM και 123 KPC. Τα στελέχη αυτά διαχωρίστηκαν σε 13 κλάσματα (clusters) με PFGE. Κατά τον έλεγχο με MLST, διαπιστώθηκε υπεροχή του κλώνου ST258 και ο ορότυπος προσδιορίστηκε ως Κ41. Από τον έλεγχο ευαισθησίας στον ορό, ευρέθη ότι το στέλεχος L-78 ήταν ευαίσθητο στο συμπλήρωμα, σε αντίθεση με το υπερλοιμογόνο στέλεχος ATCC 43816. Όσον αφορά στη φαγοκυττάρωση, ευρέθη ότι το στέλεχος L-78 φαγοκυτταρώθηκε ταχύτατα σε αντίθεση με το στέλεχος ATCC 43816. Επίσης το στέλεχος L-78 δεν ήταν ικανό να θανατώσει τα ανοσοεπαρκή πειραματόζωα, ακόμη και σε μεγαλύτερη συγκέντρωση μικροβιακού φορτίου, σε αντίθεση με το στέλεχος ATCC 43816. Σε 20 στελέχη του κλώνου ST258 που ελέγχθηκαν, εντοπίστηκαν τα γονίδια αυξημένης λοιμογονικότητας urea, uge, wabG, fimH, mrkD, entB/entE και ybtS. Ωστόσο, στερούνταν των γονιδίων magA, alls, kfuBC, cf29a, rmpA και iroΝ, τα οποία απαντώνται συνήθως σε υπερλοιμογόνα στελέχη. Aπό την ανοσιακή απάντηση σε κυτταροκαλλιέργειες μακροφάγων ποντικού, φάνηκε ότι το στέλεχος L-78 ενεργοποίησε τα μακροφάγα και παρήγαγε υψηλά επίπεδα προφλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-1β, IL-6, και TNF-α). Το στέλεχος L-78 ήταν ικανό να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή των γονιδίων του NLRP3 και της IL-1β.
Συμπέρασμα: Τα στελέχη K. pneumoniae που απομονώθηκαν από το αίμα ασθενών σε Ελληνικά νοσοκομεία παρήγαγαν κυρίως KPC και ανήκαν στον κλώνο ST258. Το αντιπροσωπευτικό στέλεχος του κλάδου Ι του ST258 που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη, ήταν ευαίσθητο στη δράση του συμπληρώματος και τη φαγοκυττάρωση, και γενικά είχε χαρακτηριστικά ελαττωμένης λοιμογονικότητας. Επίσης ενεργοποίησε τα μακροφάγα, ώστε να παραγάγουν υψηλά επίπεδα προφλεγμονωδών κυτταροκινών και προκάλεσε στατιστικά σημαντικά υψηλότερη έκλυση IL-1β σε σχέση με ένα υπερλοιμογόνο στέλεχος. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν, ότι τα στελέχη ST258, ενώ είναι χαμηλής λοιμογονικότητας, είναι ικανά να προκαλέσουν τη διέγερση του εγγενούς ανοσοποιητικού συστήματος.
