Περίληψη:
Η παρούσα μελέτη διεξήχθη στα πλαίσια του ευρωπαϊκού προγράμματος
“MICROSMETICS”, στόχος του οποίου ήταν η ανακάλυψη και η αξιοποίηση στον τομέα
των καλλυντικών, καινοτόμων προϊόντων που προέρχονται από τη παγκόσμια
βιοποικιλότητα, χρησιμοποιώντας σύγχρονες τεχνολογίες στους τομείς της
βιοτεχνολογίας, της χημείας των φυσικών προϊόντων και της εφαρμοσμένης
μικροβιολογίας.
Το συγκεκριμένο ερευνητικό πρόγραμμα περιλαμβάνει την ανακάλυψη νέων φυσικών
προϊόντων προερχόμενων από την παγκόσμια μικροβιακή βιοποικιλότητα. Ήδη
υπάρχουσες συλλογές καλλιεργειών μυκήτων και ακτινομυκήτων αξιοποιήθηκαν,
ενσωματώνοντας σύγχρονες πλατφόρμες (in silico και in vitro) για την
ορθολογική και στοχευμένη επιλογή τον πιο ελπιδοφόρων στελεχών. Προηγμένες
αναλυτικές προσεγγίσεις και τεχνικές εφαρμόστηκαν για την επιταγχυνόμενη και
αποτελεσματικότερη απομόνωση και ταυτοποίηση των βιοδραστικών μεταβολιτών.
Ενσωματώθηκε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δοκιμών για την αξιολόγηση της
αντιγηραντικής δράσης, και πιο συγκεκριμένα της αντιοξειδωτικής, προστατευτικής
και λευκαντικής δράσης. Ιδιαίτερη προσοχή δόθηκε στην επιλογή και
βελτιστοποίηση των τεχνολογιών καλλιέργιας των μικροοργανισμών σε πιλοτική
κλίμακα, ώστε να έιναι επιτυχής η παραγωγή σε μεγάλη κλίμακα των νέων δραστικών
πρώτων υλών, με σκοπό την εκμετάλλευση τους από τη βιομηχανία των καλλυντικών.
Για το σκοπό αυτό, δημιουργήθηκε ένα ακριβές λειτουργικό μοντέλο πρόβλεψης για
όλες τις γνωστές καλλυντικές λειτουργίες. Επιπροσθέτως, κατασκευάστηκαν ομόλογα
μοντέλα ειδικών υποδοχέων-στόχων (τυροσινάση, ελαστάση, υαλουρονιδάση και
κολλαγενάση) για τις οποίες έχουν ήδη αναπτυχθεί in vitro δοκιμές. Πάνω από
40,000 μικροβιακοί μεταβολίτες δοκιμάστηκαν in vitro. Συνδυάζοντας όλα τα
αποτελέσματα με το λειτουργικό μοντέλο πρόβλεψης, επιλέχθηκαν 110
μικροοργανισμοί, που ενδεχομένως έχουν την δυνατότητα να παράγουν τους εν λόγω
μεταβολίτες ή ανάλογα αυτών.
Ανάμεσα στους 110 μικροοργανισμούς, περιλαμβάνονται 54 μύκητες και 56
ακτινομύκητες που προέρχονται από τη παγκόσμια μικροβιακή βιοποικιλότητα
(συμπεριλαμβανομένων στελεχών από Αλάσκα, Ισπανία, Νέα Καληδονία, Χαβάη, Νότια
Αφρική κλπ.). Αυτά τα στελέχη καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικά καλλιεργητικά μέσα
με σκοπό το κάθε στελεχος να παράγει δέκα διαφορετικά εκχυλίσματα και με αυτόν
τον τρόπο να παραχθεί πληθώρα δευτερογενών μεταβολιτών. Συνολικά παρήχθησαν
1082 εκχυλίσματα (614 εκχυλίσματα ακτινομυκήτων και 425 εκχυλίσματα μυκήτων),
τα οποία τοποθετήθηκαν σε 96-τρυπες πλάκες, ώστε να ακολουθηθεί το “high
throughput screening”.
Πραγματοποιήθηκε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών δοκιμών για την αξιολόγηση της
αντιγήραντικής, αντιοξειδωτικής, προστατευτικής και λευκαντικής δράσης όλων των
παραγόμενων παρασκευασμάτων. Για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής δράσης των
1082 εκχυλισμάτων, πραγματοποιήθηκαν οι δοκιμές DPPH και ABTS. Η προστατευτική
δράση στο δέρμα μελετήθκε μετρώντας φασματοφωτομετρικά τις ανασταλτικές
ιδιότητες των δειγμάτων έναντι των ενζύμων ελαστάση, κολλαγενάση και πρωτεάση.
Η λευκαντική δράση αξιολογήθηκε βάσει της ικανότητας αναστολής του ενζύμου της
τυροσινάσης, χρησιμοποιώντας την L-DOPA ως υπόστρωμα. Τέλος, για λόγους
ασφάλειας, μελετήθηκε η κυτταροτοξικότητα των εκχυλισμάτων στις κυτταρικές
σειρές A2058 (κύτταρα ανθρώπινου μελανώματος) και HepG2 (ανθρώπινα ηπατικά
κύτταρα καρκινώματος) με την μέθοδο MTT. Τα αποτελέσματα των παραπάνω
βιοδοκιμών επέτρεψαν την τελική διαλογή των δραστικών και μη τοξικών
εκχυλισμάτων.
Μεταξύ των 1082 εκχυλισμάτων, 104 επέδειξαν σημαντική δράση σε τουλάχιστον ένα
στόχο. Ανάμεσα στα 104 εκχυλίσματα, τα 75 ανήκαν σε ακτινομύκητες και τα 29 σε
μύκητες. Αξίζει να σημειωθεί ότι μόλις το 11% και 6% όλων των εκχυλισμάτων
ακτινομυκήτων και μυκήτων αντίστοιχα, χαρακτηρίστηκαν ως μη τοξικά και
δραστικά. Περαιτέρω ανάλυση των αποτελεσμάτων επέδειξε και πιθανή συμβολή της
επιλογής του καλιεργητικού μέσου στη μεταβολή της δράσης.
Το επόμενο στάδιο της μελέτης, ήταν η επιλογή των 20 πιο δραστικών στελεχών που
πραγματοποιήθηκε μέσω της αξιολόγησης του χημικού προφίλ των 104 εκχυλισμάτων
χρησιμοποιώντας μία στρατηγική που συνδυάζει UHPLC και LC-HRMS, σε θετικό και
αρνητικό ιονισμό, με στατιστικές μεθόδους πολλών μεταβλητών. Παράλληλα
πραγματοποιήθηκε επανάληψη όλων των βιολογικών δοκιμών για αυτά τα 104 δραστικά
εκχυλίσματα, με στόχο να αποκλειστούν τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Τα
χρωματογραφήματα αναλύθηκαν και παρατηρήθηκε μία θετική συσχέτιση μεταξύ των
προφιλ των εκχυλισμάτων και των βιολογικών δράσεων. Έτσι επιλέχθηκαν τα 20 πιο
δραστικά εκχυλίσματα (19 στελέχη καλλιεργούμενα με 14 διαφορετικά καλλιεργητικά
μέσα), ανάμεσα στα οποία βρίσκονταν 8 από στελέχη μυκήτων και 12 από στελέχη
ακτινομύκητων, για την καλλιέργειά τους σε μεγάλη κλιμακα και για την
επαλήθευση της δράσης τους.
Τα στελέχη καλλιεργήθηκαν στο 1 L με το βέλτιστο καλλιεργητικό μέσο και
παρήχθησαν 66 εκχυλίσματα, εφαρμόζοντας διάφορα πρωτόκολλα εκχύλισης, με στόχο
την βιοκατευθυνόμενη βελτιστοποίηση της μεθόδου εχύλισης. Ανάμεσα σε αυτά τα
περισσότερα επαλήθευσαν την δράση τους κατά την ανακαλλιέργειά τους στο 1 L,
ενώ άλλα απέτυχαν. Το προφίλ των περιεχόμενων δευτερογενών μεταβολιτών
μελετήθηκε με τη βοήθεια TLC, UPLC και LC-HRMS.
Το εκχύλισμα οξικού αιθυλεστέρα του Cercospora sp. (στέλεχος CF-223709)
κατέδειξε την μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση (70.76% ± 1.28 ποσοστό δέσμευσης
της ελεύθερης ρίζας DPPH, στα 200 μg/ml), ενώ τo εκχύλισμα οξικού αιθυλεστέρα
που προήλθε από υγρή υγρή εκχύλιση (EtOAc_LL) του Streptomyces hygroscopicus
subsp. angustmyceticus (στέλεχος CA-129531) κατέδειξε την πιο σημαντική
λευκαντική δράση (74.35% ± 0.48 αναστολή του ενζύμου της τυροσινάσης, στα 300
μg/ml). Συνεπώς τα προαναφερθέντα εκχυλίσματα στελεχών επιλέχθηκαν για την
περαιτέρω τους μελέτη και απομόνωση και ταυτοποίηση των βιοδραστικών
μεταβολιτών τους.
Η ανάλυση και κλασμάτωση των εκχυλισμάτων αυτών πραγματοποιήθηκε
χρησιμοποιώντας ταυτόχρονα κλασικές χρωματογραφικές μεθόδους (ημι-
παρασκευαστική HPLC), καθώς και πιο καινοτόμες τεχνικές, όπως UPLC, SFC-MS και
FCPC. Όλα τα παραγόμενα κλάσματα μελετήθηκαν ως προς την αντιοξειδωτική και
λευκαντική τους δράση και τα πιο δραστικα από αυτά επιλέχθηκαν για περαιτέρω
κλασμάτωση είτε για ταυτοποίηση της δομής του κύριου μεταβολίτη που περιείχαν.
Το σύνολο των φασματοσκοπικών δεδομένων (LC-HRMS και 1D & 2D NMR) καταγράφηκε
για όλες τις απομονωμένες ενώσεις. Αποτέλεσμα όλων αυτών ήταν η
βιοκατευθυνόμενη απομόνωση και ταυτοποιήση των κατόθι:
• τριών δραστικών μεταβολιτών, στους οποίους οφείλεται η αντιοξειδωτική
δράση του στελέχους CF-223709, οι οποίοι περιλαμβάνουν τις γνωστές ενώσεις
φουλβικό οξύ (IC50=21.58 μg/ml, δοκιμή DPPH) και βιναξανθόνη (35.08 μg/ml,
δοκιμή DPPH), καθώς και ένα νέο φυσικό προϊόν, παράγωγο του φουλβικού οξέος, με
μοριακό τύπο C13H12O6 (IC50=18.99 μg/ml, δοκιμή DPPH).
• δύο δραστικών μεταβολιτών, που συνεισφέρουν στην λευκαντική δράση του
στελέχους CA-129531 και ταυτοποιηήθηκαν ως τριχοστατίνη Α και τριχοστατικό οξύ.
Αναμένεται ότι ακολουθώντας τα καλύτερα πρωτόκολλα εκχύλισης για το κάθε
επιλεγμένο στέλεχος και παρόμοιες μεθόδους κλασμάτωσης, θα γίνει εφικτή η
ανακάλυψη περισσότερων ικανών υποψηφίων που θα αξιοποιηθούν σε βιομηχανικό
επίπεδο. Η συγκεκριμένη μελέτη αποτελεί μία δυνατή απόδειξη ότι η παγκόσμια
μικροβιακή ποικιλότητα και οι μεταβολίτες που παράγει μπορούν να έχουν
επιτυχημένες εφαρμογές στην παγκόσμια βιομηχανία καλλυντικών.
