Κατεύθυνση Βιοχημεία
Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών

2014-11-04

2014

Κοροβίλα Ιωάννα

Γαλανοπούλου Ντία Αναπλ. Καθηγήτρια , Κωνσταντίνος Βοργιάς Καθηγητής , Δημήτριος Χατζηνικολάου Επίκ. Καθηγητής

Εξωκυτταρική παραγωγή του ανασυνδυασμένου βακτηριακού χιτινολυτικού ενζύμου Chi40 από το θερμοσταθερό βακτήριο Streptomyces thermoviolaceus σε E. coli και μελέτη της θερμοσταθερότητάς του

Ελληνικά

Extracellular production of the recombinant bacterial chitinolytic enzyme Chitinase 40 by the thermostable bacterium Streptomyces thermoviolaceus and study its stability

Το πρωτεϊνικό δομικό μοτίβο βαρέλι (α/β)8 - γνωστό και ως βαρέλι ΤΙΜ (TIM
barrel) - είναι ευρέως διαδεδομένο σε μεγάλο αριθμό οικογενειών ενζύμων που
καταλύουν ένα ευρύ φάσμα ενζυμικών αντιδράσεων, πολλές από τις οποίες είναι
βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος. Η αξιοσημείωτη δομική ευελιξία του μοτίβου
αντανακλάται ακόμη περισσότερο στο γεγονός ότι βρίσκεται σε ένζυμα που
προέρχονται από οργανισμούς που λειτουργούν σε ένα ευρύ φάσμα συνθηκών,
θερμοκρασίας, οξύτητας, αλατότητας, πίεσης κλπ. Ως εκ τούτου έχει γίνει
αντικείμενο ευρείας μελέτης σε βιοχημικό, δομικό και θερμοδυναμικό επίπεδο. Η
χιτινάση 40 (Chi40) είναι μια θερμόφιλη χιτινάση με χαρακτηριστικό δομικό
στοιχείο τη δομή βαρελιού (α/β)8. Σημαντικό χαρακτηριστικό της Chi40 είναι ότι
εμφανίζει πλήρη αντιστρεπτότητα στην αναδίπλωση της έπειτα από θερμική
αποδιάταξη. H ιδιότητα αυτή μας δίνει τη δυνατότητα να μελετήσουμε σε βάθος τον
μηχανισμό στον οποίον βασίζεται η λειτουργία της. Στόχος λοιπόν της παρούσας
μεταπτυχιακής εργασίας είναι η ανάπτυξη τεχνολογίας υψηλής παραγωγικότητας που
θα υποστηρίξει την μελέτη μεγάλου αριθμού τυχαίων μεταλλάξεων στο καταλυτικό
δομικό στοιχείο του ενζύμου. Απώτερος στόχος είναι η διαλεύκανση του μηχανισμού
αντιστρεπτής αποδιάταξης του ενζύμου αυτού σε ατομικό επίπεδο. Σε πρώτη φάση
είναι απαραίτητος ο σχεδιασμός ενός αποτελεσματικού συστήματος έκφρασης του
γονιδίου της Chi40 και παραγωγής βιολογικά ενεργού πρωτεΐνης. Το φυσικό γονίδιο
της Chi40 έχει απαγορευτικά υψηλό ποσοστό GC για πειράματα γονιδιακής-
πρωτεϊνικής μηχανικής. Το πρόβλημα αυτό λύθηκε με τον σχεδιασμό και τη σύνθεση
του συνθετικού γονιδίου της Chi40 με βελτιστοποιημένα χαρακτηριστικά έτσι ώστε
να είναι ευκολότερη η περαιτέρω γενετική του τροποποίηση και η βέλτιστη
παραγωγή του σε βακτηριακό σύστημα παραγωγής E. coli. Στη συνέχεια, και σε
σύγκριση με το αγρίου τύπου γονίδιο, μελετήθηκε η κινητική των κλώνων παραγωγής
της συνθετικής Chi40 εξετάζοντας διάφορες συνθήκες παραγωγής της. Οι συνθήκες
αυτές αφορούν χρήση διαφορετικών (α) θρεπτικών υλικών, (β) κινητικών επαγωγής
και (γ) συνδυασμούς των παραπάνω συνθηκών σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές E.
coli. Τα επίπεδα έκφρασης διέφεραν δραματικά για κάθε συνδυασμό ενώ στόχος ήταν
η ανίχνευση των βέλτιστων συνθηκών έκφρασης της εκκρινόμενης Chi40. Για την
περαιτέρω αξιολόγηση των επιπέδων έκφρασης, προσδιορίστηκε με φωτομετρικό τρόπο
η ενζυμική δραστικότητα της Chi40 με τη χρήση του συνθετικού υποστρώματος
pNP-(NAG)2. Στη συνέχεια, βασιζόμενοι στα παραπάνω δεδομένα έκφρασης και
χρησιμοποιώντας συνολική εκκρινόμενη Chi40 καταφέραμε να μετρήσουμε την
αποδιάταξή της με χρήση Διαφορικής Φθορισμομετρίας Σάρωσης (DSF). Ακολούθησε
καθαρισμός της πρωτεΐνης με υδρόφοβη χρωματογραφία και χρωματογραφία
ιονανταλλαγής. Έπειτα ακολούθησε Φασματομετρία Μάζας (MS) για την ταυτοποίηση
του ενζύμου, ενώ μη αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση και το πείραμα δυναμικής
σκέδασης φωτός (DLS) απέδειξαν πως το ένζυμο απομονώθηκε σε μονομερή μορφή,
χωρίς τη δημιουργία συσσωματωμάτων. Τέλος, το πείραμα κυκλικού διχρωισμού (CD)
για τη μελέτη θερμοσταθερότητας έδειξε πως η Chi40 έχει σημείο τήξης Τm 60.9oC
σε ουδέτερο pH. Τα αποτελέσματα αυτά μας ανοίγουν τον δρόμο της μελέτης της
θερμικής αποδιάταξης της Chi40 γρήγορα και αποτελεσματικά από μεγάλο αριθμό
τυχαίων μεταλλάξεων που θα παραχθούν στο εργαστήριο μας με τη χρήση της
τεχνολογίας της κατευθυνόμενης εξέλιξης και τη συλλογή δεδομένων που πιθανόν να
μας δώσει αρκετά δεδομένα για τη διαλεύκανση του μηχανισμού της αντιστρεπτής
αποδιάταξης της Chi40. Απώτερος στόχος είναι εφαρμογή των δεδομένων αυτών σε
ένζυμα βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος για να τους προσθέσει σταθερότητα και
μεγάλο χρόνο ζωής σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές.

Χιτινολυτικά ένζυμα, Χιτινάση 40, Δομικό μοτίβο (α/β)8, Βαρέλι ΤΙΜ

Ναι

12-19, 145

Ναι

67

152

https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/1317294/file.pdf

https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/1317294